文献|协和医院徐英春教授发布关于真菌药敏检测系统性能

近日，国际期刊《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》（影响因子：6.073）刊登了由北京协和医院检验科徐英春教授团队牵头开展的基于专利实时荧光技术开发的全自动真菌药敏检测系统Droplet48的性能评估研究报告。

近年来，越来越多的患者出现了侵袭性真菌感染，耐药真菌病原体传播更加广泛，尤其是在医疗中心有复杂基础疾病的患者，如免疫功能受损的患者、暴露于长疗程广谱抗生素的患者以及植入医疗器械的患者，更加容易遭受侵袭性真菌感染。抑制真菌耐药性传播和出现的关键在于有效的干预措施：包括快速检测和耐药监测，抗微生物药物管理等。真菌药敏试验(AFST)提供抗真菌药物的最低抑菌浓度(MIC)，以支持临床医师治疗真菌感染，监控耐药性的出现和传播。

近30年间，只有少数真菌药敏试验（AFST）方法得以广泛应用，用于检测真菌分离株的mic。如临床和实验室标准协会(CLSI）发布的微量肉汤稀释(BMD)参考方法，以及欧洲抗菌药物敏感性试验委员会抗真菌小组委员会(EUCAST) 发布的方法。BMD方法作为AFST的金标准，检测过程需要大量人力，且价格昂贵;因此，作为临床微生物实验室常规使用很难得以广泛开展。为了更好的监测真菌药敏，协和医院徐英春教授团队在本文中研究了一种新型的快速自动化AFST检测方法。

检测原理

上图显示了该方法的检测原理：Droplet 48实时监测含有不同浓度抗真菌剂的微稀释孔的荧光，并通过荧光强度随时间的变化拟合菌株的生长特性。如果抗真菌药物的浓度（3号和4号）高于被测菌株的最低抑制浓度（MIC），与含有较低MIC的微稀释孔（No.1和No.2，No.2的生长速度比No.1稍慢）相比，菌株的生长特性发生了明显的变化。（B-D）克柔氏念珠菌在不同浓度的伊曲康唑（B）、卡泊芬净（C）和两性霉素B（D）的作用下的生长特性。检测过程中会有一些物质干扰荧光信号。根据之前积累的菌株生长数据，通过排除背景信号并加入不同的修正算法，最终得到了这些抗菌药物的MIC值。黑体和红色数字表示抗真菌剂的MIC和阳性报告时间。

研究设计

1.真菌菌株

144株来自临床常见系统性感染真菌菌株，分别是16株白色念珠菌，16株克柔氏念珠菌，13株热带念珠菌，13株近平滑念珠菌，13株葡萄牙假丝酵母菌，10株光滑假丝酵母菌，10株季也蒙念珠菌和10株新生隐球菌，还有11株阿萨希毛孢子菌，22株皮炎外瓶霉，以及11株来自于随机从罕见的血流感染患者中分离培养出来的菌株。所有菌株都是从血液或其他无菌身体部位（脑脓肿和腹腔内样本）分离培养出来的。

2.抗真菌药敏实验

将所有菌株在沙保乐葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂上进行传代培养，并再次传代培养，以确保菌株的纯度和活力，然后分别按照D48和Sensititre YeastOne (SYO) 操作要求进行9种药物的药敏实验，9种药分别是：氟康唑，伏立康唑、 伊曲康唑、泊沙康唑、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B和5-氟胞嘧啶。

3.数据分析

临床折点（Clinical breakpoints，CBs）和流行病学界值（epidemiology cut-off values，ECVs）依据2022 CLSI文件 M57S第四版和M27M44S第三版作为判定标准。根据CLSI 指南M52文件，分析D48和SYO两种方法学一致性包括基本一致性（essential agreement，EA）和分类一致性（Categorical agreement ，CA）。EA：试验方法D48的MIC值与参考方法SYO的MIC值上下相差不超过2个稀释度；CA: 试验方法药敏结果与参考方法判断结果同一类的百分比（药敏结果分类包括敏感、中介、耐药，剂量依赖敏感）。

研究结果

1. 重复性100%：D48在±2稀释范围内的重复性为100%；

2. 药物浓度梯度：D48的药物浓度梯度更多，可以同时检测96个不同浓度的药物，符合中国临床真菌分离物检测需要；

3. 总样本的基本一致性EA除泊沙康唑为86.62%外，其余药物EA均大于90%；总样本分类一致性CA除伏立康唑为87.93%外，其余药物CA均大于90%。

徐教授研究团队采用11 株分离于临床血液中的不常见真菌菌株，同时用D48和SYO进行真菌药敏实验，结果发现D48除了粘液毛孢子菌的卡泊芬净和泊沙康唑、挪威假丝酵母菌的阿尼芬净、酿酒酵母菌的两性霉素B和氟康唑的MIC值与SYO的差异大于2个稀释度，其他的均与SYO的基本一致性EA达到100%。