微RNA‑27a通过PI3K/Akt信号通路调控大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究

徐桂萍1 古文玉2 陈哲1 王晓丽1　

1新疆维吾尔自治区人民医院麻醉科，新疆麻醉管理临床医学研究中心，乌鲁木齐 830001；2石河子大学医学院，石河子 832003

国际麻醉学与复苏杂志,2023,43(06):567-574.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20221124‑00811

基金项目 

国家自然科学基金（81860345）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟通过下调或过表达miR‑27a观察其对大鼠心肌酶谱水平、氧化应激水平及磷脂酰肌醇‑3‑激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的影响，初步探讨其作用机制。 

1、材料与方法

清洁级雄性SD大鼠，体重220~280 g，8~10周龄，96只大鼠按随机数字表分为6组（每组16只）：假手术组（Sham组）、心肌缺血再灌注组（IR组）、腺相关病毒（AAV）空白对照+IR组（AVV‑NC组）、过表达miR‑27a+IR组（AAV‑miR‑27a组）、低表达miR‑27a+IR组（AAV‑miR‑27a‑antago组）、低表达miR‑27a+IR+PI3K抑制剂组（LY组）。AAV⁃miR⁃27a组于造模前14 d尾静脉注射AAV⁃miR⁃27a进行过表达干预，AAV⁃miR⁃27a⁃antago组与LY组造模前14 d尾静脉注射AAV⁃miR⁃27a⁃antago进行低表达干预。结扎大鼠冠状动脉左前降支（LAD）30 min再灌注120 min制备MIRI模型。LY组于造模前30 min腹腔注射PI3K抑制剂LY294002（1.5 mg/kg）。再灌注120 min后，取血样，采用ELISA法检测各组大鼠血清中肌钙蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK‑MB）的浓度；比色法检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）活性；处死大鼠，摘取心脏切片进行H‑E染色观察心肌组织病理学变化，伊文蓝‑2，3，5‑氯化三苯基四氮唑（TTC）法检测大鼠心肌梗死面积；比色法检测心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平；采用Western blot法测定心肌组织PI3K、Akt及磷酸化（p）‑PI3K、p‑Akt的蛋白水平。

2、结 果

2.1各组大鼠心肌梗死面积比较

与Sham组比较，IR组心肌梗死面积百分比升高（P<0.05）。与IR组比较，AAV‑miR‑27a组心肌梗死面积百分比升高（P<0.05），AAV‑miR‑27a‑antago组心肌梗死面积百分比降低（P<0.05）。与AAV‑miR‑27a‑antago组比较，LY组心肌梗死面积百分比升高（P<0.05）。AVV‑NC组心肌梗死面积百分比与IR组差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2各组大鼠心肌病理结果比较

Sham组心肌细胞胞质染色均匀，未见肌纤维断裂，未见炎症细胞浸润。IR组心肌细胞胞质染色不均匀，界限不清，伴间质水肿增宽，心肌纤维出现断裂，心肌纤维间可见中性粒细胞浸润。AAV‑miR‑27a组的心肌细胞病理改变严重，心肌细胞弥漫性溶解坏死，伴有心肌间质显著水肿增宽，肌纤维断裂，心肌纤维间散在炎症细胞浸润。AAV‑miR‑27a‑antago组与IR组、AAV‑miR‑27a组比较上述病理情况均有一定的改善，心肌细胞轻度肿胀，灶状坏死，间质轻微水肿增宽，少量炎症细胞浸润。与AAV‑miR‑27a‑antago组比较，LY组病理改变加重。见图2。

2.3各组大鼠血清cTnT、CK‑MB浓度及LDH活性比较

与Sham组比较，IR组血清cTnT、CK‑MB浓度升高，LDH活性增加（P<0.05）。与IR组比较：AAV‑miR‑27a组血清cTnT、CK‑MB浓度升高，LDH活性增加（P<0.05）；AAV‑miR‑27a‑antago组血清cTnT、CK‑MB浓度降低，LDH活性降低（P<0.05）。与AAV‑miR‑27a‑antago组比较，LY组血清cTnT、CK‑MB浓度升高，LDH活性增加（P<0.05）。AVV‑NC组与IR组比较，cTnT、CK‑MB浓度及LDH活性差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.4各组大鼠心肌组织SOD、GSH及MDA水平比较

与Sham组比较，IR组心肌组织SOD和GSH的水平降低，MDA水平增加（P<0.05）。与IR组比较：AAV‑miR‑27a组心肌组织SOD和GSH的水平降低，MDA水平增加（P<0.05）；AAV‑miR‑27a‑antago组心肌组织SOD和GSH水平增加，MDA水平降低（P<0.05）。与AAV‑miR‑27a‑antago组比较，LY组心肌组织SOD和GSH水平降低，MDA水平增加（P<0.05）。AVV‑NC组与IR组各指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.5各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、p‑PI3K和p‑Akt蛋白水平比较

与Sham组比较，IR组心肌组织p‑PI3K和p‑Akt表达上调（P<0.05）。与IR组比较，AAV‑miR‑27a组p‑PI3K、p‑Akt表达下调（P<0.05），AAV‑miR‑27a‑antago组p‑PI3K、p‑Akt表达上调（P<0.05）。与AAV‑miR‑27a‑antago组比较，LY组心肌组织p‑PI3K、p‑Akt表达下调（P<0.05）。AVV‑NC组与IR组p‑PI3K、p‑Akt表达差异无统计学意义（P>0.05）。且各组大鼠PI3K、Akt表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3、表3。

3、讨 论

本研究结果示，IR组cTnT、CK‑MB及LDH水平升高，心肌出现形态学改变，氧化应激反应增强，说明大鼠MIRI模型制备成功。与IR组比较，AAV‑miR‑27a组血清cTnT、CK‑MB浓度及LDH活性升高，心肌梗死面积增加，光镜下心肌纤维排列明显紊乱，细胞肿胀，边界模糊。而AAV‑miR‑27a‑antago组心肌上述改变得到缓解，提示下调miR‑27a表达降低可缓解大鼠MIRI。

本研究结果显示，与Sham组比较，IR组p‑PI3K、p‑Akt表达水平升高，SOD和GSH水平下降，MDA水平升高，这与以往的研究结果一致。可能是由于MIRI引起氧化应激反应，PI3K/Akt信号通路作为内源性抗氧化机制被激活。与IR组比较，AAV‑miR‑27a组p‑PI3K、p‑Akt蛋白水平下降，心肌组织SOD和GSH水平下降、MDA水平升高；而AAV‑miR‑27a‑antago组p‑PI3K、p‑Akt蛋白水平升高，心肌组织SOD和GSH水平升高、MDA水平下降；在下调miR‑27a表达的基础上进一步使用PI3K抑制剂后，p‑PI3K、p‑Akt蛋白水平下降，心肌组织SOD和GSH水平下降、MDA水平升高，血清cTnT、CK‑MB浓度及LDH活性升高；以上结果提示下调miR‑27a表达可能会激活PI3K/Akt信号通路，抑制氧化应激反应，降低心肌酶谱水平，减轻MIRI。

综上所述，下调miR‑27a对大鼠MIRI产生保护作用的机制可能与激活PI3K/Akt信号通路以及抑制氧化应激反应有关。

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