科研丨EBioMedicine: 1型糖尿病青少年的微生物分类和功能变化与临床和饮食因素有关

编译：微科盟煎蛋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   有证据表明，1型糖尿病(T1D)的发病机制与肠道微生物组之间存在联系。然而，T1D中微生物代谢途径的调控以及细菌物种与饮食因素的关系在很大程度上仍然未知。本研究调查了T1D青少年的微生物宏基因组特征是否与临床/饮食因素相关。招募患有T1D的青少年(病例)和健康青少年(对照)，并使用鸟枪宏基因组测序对参与者粪便样本进行微生物组分析。收集临床(HbA1c)和饮食信息(3天饮食记录)，使用Spearman相关性进行关联分析。结果显示，T1D青少年的肠道微生物组的分类组成发生了改变。T1D中有19条微生物代谢途径发生了改变，包括维生素(B2/黄素、B7/生物素和B9/叶酸)、辅酶因子(NAD+和s-腺苷甲硫氨酸)和氨基酸(天冬氨酸、天冬酰胺和赖氨酸)的生物合成下调，发酵途径上调。此外，与饮食和临床因素相关的细菌种物种在健康青少年和T1D青少年之间存在差异。监督模型建模确定了可预测T1D状态的分类群，主要特征包括粪球菌(Coprococcus)和链球菌(Streptococcus)。本研究为T1D青少年的微生物和代谢特征的改变提供了新的见解，表明维生素、辅酶因子和氨基酸的微生物生物合成可能在T1D患者中发生改变。    

论文ID

原名：Microbial taxonomic and functional shifts in adolescents with type 1 diabetes are associated with clinical and dietary factors

译名：1型糖尿病青少年的微生物分类和功能变化与临床和饮食因素有关

期刊：EBioMedicine

IF：11.1

发表时间：2023.6

通讯作者：Pon Velayutham Anandh Babu

通讯作者单位：美国犹他大学

DOI号：10.1016/j.ebiom.2023.104641

实验设计

结果

1 参与者特征

患有1型糖尿病(T1D)的青少年HbA1c值显著高于健康青少年(P < 0.001)(表1)。两组在年龄、BMI百分位数、体脂百分比、腰围、胃肠道严重程度指数、皮肤类胡萝卜素评分、体力活动水平或饮食摄入量(卡路里、碳水化合物、蛋白质、脂肪、纤维、糖和添加糖)方面均无显著差异。

表1. 健康青少年和1型糖尿病青少年的队列特征比较。  

2 T1D青少年在不同的分类水平上表现出肠道微生物组组成的变化

对健康青少年和患有T1D的青少年进行比较，以获得T1D的微生物组特征。通过Chao1、InvSimpson、Observed、Shannon和Simpson指数评估α-多样性(表示样本内的物种丰富度和均匀度)。这些α-多样性指数在各组之间没有显著差异(图1A)。β-多样性是衡量整体微生物组成的指标，在健康青少年和T1D青少年之间没有显著差异(图1B)。采用Aitchison距离和Jaccard距离估计样本之间的多变量距离，结果显示两组间β-多样性无显著差异(图1B)。在本研究中，细菌序列分布于11门，34纲，42目，58科，196属，344种。分类丰度的定性测量结果表明，不同分类水平上的微生物群落差异不大。图1C显示了两组在属水平上的相对丰度。此外，MaAsLin2鉴定出粪球菌属(Coprococcus)在患有T1D的青少年中增加(P = 0.0003，q值= 0.062，图1D)。显示差异的分类群(属和种)包含在补充表S1中(P <0.05)。没有物种达到q值＜0.1的先验显著性阈值。

图1. 健康青少年和T1D青少年肠道微生物的多样性和组成。(A) α-多样性图，(B)使用Jaccard距离、Jaccard指数和Aitchison距离绘制的β-多样性图，(C)属水平的相对丰度，以及(D) T1D富集的属。数据表示为平均值±SE[健康青少年(n=35)和T1D青少年(n=30)]。

3 T1D青少年维生素、辅酶因子和氨基酸的微生物生物合成下调，而发酵途径上调

HUMAnN 3.0是可以从宏基因组数据中分析群落中微生物通路存在/缺失和丰度的有效而准确的途径。本研究观察到健康青少年和T1D青少年之间19种微生物通路的差异，未调整的P值<0.05(图2A和补充表S2)。T1D青少年中与维生素生物合成、辅酶因子生物合成和氨基酸生物合成相关的微生物通路下调，而发酵通路上调。与T1D中维生素生物合成相关的下调微生物通路包括(i) B2/核黄素[黄素生物合成I(RIBOSYN2-PWY)]、(ii) B7/生物素[生物素生物合成II(PWY-5005)]以及(iii) B9/叶酸[6-羟甲基二氢蝶呤二磷酸生物合成I(PWY-6147)和6-羟甲基二羟基蝶呤二磷酸生物合成III(PWY-7539)](图2B)。黄素除了作为维生素B2的作用外，还作为辅酶因子和电子载体，NAD+作为辅酶因子和电子载体。患有T1D的青少年表现出辅酶因子的微生物生物合成下调，如NAD+[来自天冬氨酸的NAD生物合成I(PYREDDUCSYN-PWY)]和s-腺苷甲硫氨酸[s-腺苷-L-甲硫氨酸循环I(PWY-6151)](图2B)。T1D中下调的微生物氨基酸通路包括L-天冬氨酸和L-天冬酰胺生物合成超通路(ASPASN-PWY)，以及L-赖氨酸生物合成III(PWY-2942)(图2B)。在患有T1D的青少年中，与发酵相关的两种微生物通路被上调：(i)己糖醇发酵为乳酸、甲酸、乙醇和乙酸盐(P461-PWY)和(ii)混合酸发酵(发酵-PWY)(图2B)。健康青少年和T1D青少年之间的几种微生物前体代谢物和能量通路也发生了变化(图2A)。使用调整后的P值<0.05，没有微生物通路达到显著性差异(补充表S2)。

图2. T1D中微生物功能通路改变。(A)基于健康和T1D平均值的上调和下调微生物功能通路的热图，(B)维生素生物合成、辅酶因子生物合成、氨基酸生物合成和发酵通路。数据表示为平均值±SE[健康青少年(n=35)和T1D青少年(n=30)]，* P <0.05(未经调整的P值)。

4 与饮食和临床因素相关的大多数细菌物种在健康青少年和T1D青少年之间存在差异

本研究确定了两组(健康青少年和T1D青少年)的细菌物种与临床/饮食因素(HbA1c、BMI百分位数、皮肤类胡萝卜素、体力活动、胃肠道严重程度指数、膳食营养素、血糖负荷、胰岛素生成、胰岛素指数和膳食植物化学物质)之间的关联是否相似或不同。采用3天(短时间)食物记录法测定各组宏量、微量营养素的膳食摄入量。利用近一年(长时间)膳食摄入量的YAQ信息计算植物营养素的膳食摄入量。利用MaAsLin2鉴定的排名靠前的分类群(9属16种)用于该相关性分析。与大多数这些因素相关的细菌物种在健康青少年和患有T1D的青少年之间存在差异(图3A–E)。  

图3. 健康青少年和T1D青少年之间与饮食和临床因素相关的细菌物种存在差异。健康青少年和T1D青少年的细菌物种与临床/人体测量/生活方式和饮食因素(A-E)之间的Spearman相关性。仅显示了P＜0.05的相关性。

5 监督预测模型识别与T1D状态相关的分类群

本研究使用随机森林模型来识别数据中最重要的特征和模式，然后应用这些模式和特征来预测与T1D相关的物种丰度。MUVR分析产生的模型在变量和模型过拟合方面偏差最小。本研究通过MUVR算法对细菌分类群进行了鉴定，前25个分类群属如补充表S3所示。使用物种水平丰度的主要特征包括Alistipes putedinis、Eubacterium ventriosum和Coprococcus comes(图4A)。MUVR预测建模变量如图4B所示。该模型的准确率(分类正确率)为71%，受试者工作特征曲线下面积为0.70，表明仅具有中等性能。该模型的敏感性和特异性分别为0.77和0.63。当使用物种水平数据时，模型的准确性提高到73.8%。使用属数据建立的模型显示I型和II型误差分别为0.36和0.22。

当包括属和种时，监督XGBoost模型也显示出中等的性能(图4C)。预测的结果是分类的，因此使用混淆矩阵来评估模型性能。10倍交叉验证的总体准确率(正确分类百分比)为70.6%。敏感性和特异性分别为0.72和0.7，受试者工作特征下总面积(AUROC)为0.71(图4D)。这些模型还确定了粪球菌属(Coprococcus)、Baludia和链球菌属(Streptococcus)是最具鉴别性的菌属。除此之外，Alistipes putedinis、Eubacterium ventriosum和Adlercreutzia equolifaciens也具有T1D状态的鉴别性(补充表S3)。MUVR分析中确定的几乎所有分类群在XGBoost分析中也被发现是预测变量。最后，基于排列的特征重要性对模型性能的评估(通过排列后的1-AUC评估)确定了Coprococcus、Streptococcus和Anaerobutyricum在前5个最具贡献的分类群中的丰度(图4E)。因此，多种分析表明了T1D个体中粪球菌和链球菌属变化的重要性。

图4. 监督模型识别与T1D状态相关的分类群。与T1D状态相关的排名靠前的物种水平分类群和使用MUVR多元随机森林建模的模型性能矩阵(A和B)。使用XGBoost模型确定的种属和性能矩阵(C和D)。与XGBoost模型中基于排列的特征重要性评估相关的分类群(E)。  

讨论

新出现的证据表明，肠道微生物组与宿主的免疫系统相互作用，并被认为是T1D发展的主要环境影响因素之一。T1D中肠道微生物组组成的变化已被充分记录。然而，T1D中微生物代谢通路的调控以及细菌物种与饮食/临床因素的关联在很大程度上是未知的。本研究评估了T1D青少年患者的微生物分类和功能变化，并确定这些变化是否与临床和饮食因素有关。首先，MaAsLin2鉴定的分类差异在健康青少年和T1D青少年之间仅显示出细微的差异。其次，微生物代谢通路，包括维生素生物合成(B2/黄素、B7/生物素和B9/叶酸)、辅酶因子生物合成(s-腺苷甲硫氨酸和NAD)和氨基酸生物合成(天冬氨酸、天冬酰胺和赖氨酸)，以及发酵途径在T1D中发生了改变。第三，健康青少年和T1D青少年之间与饮食和临床因素相关的细菌物种存在差异。最后，作者用MUVR进行的初步研究确定了可预测T1D状态的细菌分类群，使用属水平丰度的主要特征包括Coprococcus和Streptococcus。 人类研究表明T1D与肠道微生物多样性之间存在关联，尽管并非所有研究都报告了这种关联。在本研究中，健康青少年和T1D青少年之间α多样性和β多样性无显著差异。在芬兰和意大利进行的研究表明，T1D的微生物多样性降低。然而，来自四个地理位置不同的国家的研究表明，α-多样性和β-多样性没有明显差异，这表明地理位置对肠道微生物多样性的影响。这些研究表明，地理位置可能会影响肠道微生物的多样性。在本研究中，健康青少年和T1D青少年之间仅观察到细微的分类差异。差异最显著的是Coprococcus的丰度。先前的研究已经观察到T1D患者链球菌增加。链球菌参与T1D的发展是由于其产生谷氨酸脱羧酶的能力，这可能通过分子模拟触发自身免疫。在本研究的分析中，作者注意到链球菌增加，但这并不符合先验显著性阈值(P值=0.007，q值=0.76)。

本研究确定了T1D青少年中微生物功能通路的下调。在易患T1D的婴儿中进行的一项研究显示，芳香族氨基酸、辅酶因子和维生素的微生物生物合成发生了变化，但具体的维生素和辅因子在本研究中未被确定。本研究表明，T1D青少年中特定维生素、辅酶因子和氨基酸的微生物生物合成下调，微生物发酵途径上调。有限的证据表明维生素B对T1D有影响。维生素B的使用和宿主的免疫力受到肠道微生物组组成和功能潜力的影响。在本研究中，维生素B(B2/核黄素、B7/生物素和B9/叶酸)的微生物生物合成在T1D中下调。肠道细菌产生的核黄素直接被结肠吸收。生物素是肠道微生物生长和生存所必需的，其缺乏会导致肠道微生态失调。核黄素的饮食摄入减少与人类从胰岛免疫发展为T1D的风险增加有关。生物素干预被证明可以降低T1D患者的HbA1c。叶酸是一种调节免疫系统的结肠代谢产物。结肠是叶酸的储存库，有助于生成生物可利用的叶酸。人类肠道微生物产生的短链脂肪酸和叶酸局部稳定结肠中的T调节性细胞(Tregs)。然而，细菌定植的变化减少了叶酸和短链脂肪酸的产生，从而导致自身反应免疫原性T效应细胞(Teffs)的相对增加。然后，Teffs从结肠迁移到靶组织，并通过改变免疫原性细胞(Teffs)与调节性细胞(Tregs)的比例引发自身免疫性疾病。因此，叶酸合成的下调可能会改变Teffs与Tregs的比例，并导致T1D。

患有T1D的青少年表现出辅酶因子NAD+和s-腺苷甲硫氨酸的微生物生物合成下调。由于过量底物(葡萄糖、乳酸和游离脂肪酸)的氧化，糖尿病组织中胞质NAD+/NADH明显减少。这会影响乳酸/丙酮酸的比例，导致乳酸盐的产生增加，而乳酸盐能够在器官之间传递氧化还原变化。事实上，高血浆乳酸浓度与患糖尿病的风险增加有关。在本研究中，NAD生物合成和S-腺苷甲硫氨酸(在维持细胞膜中起作用)在T1D中下调。有证据表明，甚至在胰岛自身抗体和T1D临床出现之前，宿主氨基酸代谢就失调了。流行病学研究表明，支链氨基酸与胰岛素抵抗之间存在实质性联系。本研究发现T1D中L-天冬氨酸、L-天冬酰胺和L-赖氨酸的微生物生物合成下调。 两种微生物发酵途径在患有T1D的青少年中上调。甘露醇是糖尿病患者使用的一种人工甜味剂，山梨醇用于无糖口香糖和含片。这些糖醇由利用糖的细菌(如链球菌)发酵而成。己糖醇发酵的上调表明，患有T1D的青少年对人工甜味剂的摄入量增加，并且与T1D中富集的链球菌有关。此外，混合酸发酵在T1D中上调，这可能会增加宿主的血浆乳酸浓度，这是糖尿病的一个风险因素。T1D中能量通路的改变可能是由于T1D中辅酶因子和/或电子载体(NAD+和黄素)的生物合成下调。总之，本研究表明，微生物功能通路可能是预防或延缓T1D发病的潜在靶点。先前的一些研究表明，T1D中拟杆菌的丰度增加，短链脂肪酸发酵途径下调。我们在本研究中没有观察到这种影响。这可能是由于特定的人口(青少年)和地理位置的差异。 关联分析表明，健康青少年和T1D青少年之间与饮食和临床因素相关的细菌物种不同。例如，在健康青少年中，链球菌与HbA1C呈负相关，但在患有T1D的青少年中未观察到这种关联。健康组Christensenella与膳食脂肪和蛋白质呈负相关，而T1D组无相关性。此外，在健康青少年中，Steptococus salivarius与维生素A、B2、B3、B6、B12和C呈负相关，但在T1D中无关。两个分类群(GGB9632和SGB9632_SGB15089)与T1D患者的血糖负荷和胰岛素负荷呈正相关，但在健康人群中没有。健康组和T1D组植物营养素与物种之间的相关性不同。监督建模方法的组合确定了可预测T1D状态的细菌分类群，使用属水平丰度的主要特征包括在T1D青少年中富集的属(粪球菌属和链球菌属)。 本研究具有几个优势，包括具有匹配良好的健康对照(12-17岁)的研究设计、鸟枪宏基因组学鉴定T1D中微生物组组成和微生物功能的改变、确定细菌物种与临床/饮食因素之间的关联，以及利用机器学习方法确定T1D预测分类群。本研究也存在一些局限性。本研究没有收集病程信息。病例对照研究设计的固有性质，其中只有关联可以推断。此外，需要更大的样本量以实现更大的统计能力、可推广性，并解释微生物组中固有的个体间差异，这可能对差异的检测有限。

结论

本研究确定了T1D青少年肠道微生物群的组成和功能潜力，以及它们与临床和饮食因素的关系。本研究发现T1D青少年的微生物分类和功能变化与临床和饮食因素有关。使用监督预测模型来识别与T1D状态相关的细菌分类群，使用属水平丰度的主要特征包括Coprococcus和Streptococcus。本研究为T1D中细菌宏基因组特征的改变提供了新的见解。