文献精读 | MMP-9抑制剂可预防帕金森疾病中AQP4去极化介导的类淋巴系统功能障碍

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前言

INTRODUCTION

帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，其特征是黑质（SN）多巴胺能（DA能）神经元变性和α-突触核蛋白的异常聚集，从而导致路易小体异常聚集。类淋巴系统是清除病理性蛋白和代谢产物一条血管旁途径。在帕金森病（PD）类淋巴系统功能发生障碍与PD疾病机制相关，但其具体分子机制仍不明确。

水通道蛋白-4（AQP4）是一种促进水和溶质高速运输的通道蛋白，其在星形胶质细胞终足的定位（AQP4极化）对类淋巴系统的有效运转至关重要。许多证据已揭示AQP4的异常表达与神经退行性疾病的病理进展之间的联系。既往研究表明，AQP4极性表达模式取决于完整的肌营养不良聚糖复合物（DG）。DG则位于星形胶质细胞终足膜上，由细胞外α亚基（α-DG）和跨膜β亚基（β-DG）组成。β-DG的结构完整性对基膜（BM）与星形胶质细胞膜接触及AQP4极化至关重要，而β-DG的细胞外N末端是一种基质金属蛋白酶-9（MMP-9）切割的特异性底物。MMP-9可由神经元和神经胶质细胞合成并释放到细胞外空间，破坏细胞基质稳态并在神经炎症和神经变性过程中发挥作用。

因此作者提出假设：PD病程中活化的MMP-9释放并浸润至血管周围区域，切割β-DG的细胞外结构域，导致基膜与星形胶质细胞终足接触区的结构不稳、AQP4蛋白去极化，从而引起类淋巴系统功能障碍。抑制MMP-9可以抑制AQP4去极化介导的类淋巴系统功能障碍，以及部分缓解代谢紊乱和DA能神经元变性。假设机制的示意图如下：

示意图

方法

METHODS

实验设计

使用C57BL/6野生型小鼠（8周龄）和A53T小鼠（PD转基因小鼠，表达人类的α-syn变种，4月龄）用于实验。在三天的行为测试预训练后，连续四次、间隔2小时，腹腔注射MPTP（20mg/kg）进行PD造模，对照组给予生理盐水。AQP4抑制剂（TGN020）在最后一次注射MPTP或生理盐水后的第三天给药（i.p.）; MMP-9抑制剂（GM6001）, 在最后一次MPTP或生理盐水注射后2小时给予（i.p.），后续每24小时再进行一次治疗，持续2天。对照小鼠给予等量助溶剂。在最后一次注射MPTP或生理盐水后7天对所有小鼠实施安乐死。

类淋巴功能检测

①流入功能：使用5ul体外荧光染料（0.5%A594，759D）注入小脑延髓池，30min后灌流取脑，切取100um厚度的冠状脑片。

②流出功能：利用两种不同分子量大小的荧光染料（0.5% A594（759D）和0.5% FITC-D2000（2000KDa））注射到纹状体，2h后灌流取脑，切片厚度为50um，以评估全脑、大脑皮层、纹状体、海马体、中脑和黑质中的平均荧光强度。

结 果

RESULTS

MPTP诱导的PD小鼠类淋巴系统功能发生障碍

流入功能定量分析显示，与生理盐水组相比，MPTP组脑片中示踪剂荧光强度降低了31%（MPTP组：7.49±0.54，n=4；生理盐水组：10.89±1.38，n=4，t检验：p=0.0037），尤其是在中脑和黑质（中脑，p＜0.0001；黑质，p＜0.001；图1A-E）。MPTP组纹状体和黑质处的沿穿透小动脉的示踪剂荧光强度较生理盐水组显著降低。研究者使用间质液中不同分子量的示踪剂（小分子A594，大分子FITC-D2000）从大脑中的清除率来代表流出功能。在向纹状体内注射示踪剂后2小时，MPTP组纹状体内的示踪剂残留显著增高（A594：MPTP组：17.31±5.07，n=5，生理盐水组：9.61±4.31，n=4，t检验：p=0.047；FITC-d2000：MPTP组：29.72±5.50，n=5；生理盐水组：16.58±8.35，n=4；t检验：p=0.025；图1G-H）。图1I显示了示踪剂扩散可达大脑内静脉以及实质组织内的穿通血管旁。MPTP组中小分子量的A594分布于血管旁空间和脑组织中，而大分子量的FITC-d2000分布主要局限于血管旁空间。

图 1

MPTP诱导的PD小鼠AQP4表达减少且极性降低

AQP4表达水平和极性分析显示，MPTP组纹状体和黑质的AQP4阳性细胞个数（纹状体，p = 0.0030; 黑质, p < 0.001）及AQP4极化率（纹状体, p = 0.0106; 黑质, p < 0.001）明显降低（附图1A-B）。WB结果显示，MPTP组的纹状体（AQP4-M1, p = 0.0163; AQP4-M23, p = 0.0398）和黑质（AQP4-M1, p = 0.0398; AQP4-M23, p = 0.0152）两处的AQP4-M1和AQP4-M23的表达也显著降低。两组的AQP4-M23/M1没有差异（附图1C-F）。

附图 1

AQP4抑制剂减少类淋巴系统引流并加重PD病理特征

作者接下来使用TGN-020以验证AQP4在PD类淋巴系统中的作用。WB分析显示，相比于MPTP组，MPTP + TGN-020组纹状体内AQP4-M1（p＝0.017）和AQP4-M23 (p = 0.0049)水平显著降低，AQP4-M23/M1 (p > 0.05)比值降低（图2A-B）。此外，相比于MPTP组，MPTP+TGN-020组纹状体（p>0.05）和黑质（p=0.0436）中的GFAP阳性区面积增加，终足上AQP4沿着血管的覆盖率和强度降低，而盐水和盐水+TGN-020组的GFAP阳性区面积没有变化（图2C-D）。与MPTP组相比，MPTP+TGN-020组显示出类淋巴系统效率降低（生理盐水组：8.8±0.65，n=4；MPTP组：6.71±0.73，n=4，生理盐水+TGN-020组:6.71±0.74，n=5；MPTP+TGN-020组：5.37±0.70，n=5，单因素方差分析：p<0.0001；图3A-B）。

作者通过评估运动表现和TH阳性神经元活性，进一步研究了类淋巴系统功能障碍对动物行为和神经病理特征的影响。旷场实验中，MPTP组表现出运动减少（p=0.029）。MPTP组和MPTP+TGN-020组之间没有观察到显著差异（p>0.05；图3C-E）。MPTP组纹状体的TH神经元密度（0.728±0.041，p=0.004）和黑质TH神经元密度（53.75±3.326，p<0.0001）低于生理盐水组。此外，与MPTP组相比，MPTP+TGN-020组纹状体中的TH神经元密度进一步降低了约37%（p＜0.0001），黑质中的TH阳性神经元密度进一步减少了35%（p＝0.0387）（图3F-G）。

图 2

图 3

MMP-9介导A53T和MPTP诱导的PD小鼠的β-DG切割

为验证MMP-9是否在PD小鼠模型中切割β-DG，作者在A53T PD转基因小鼠和MPTP诱导的PD小鼠中进行验证。在A53T小鼠中，前体MMP-9（p=0.0020）和裂解的β-DG（p=0.0260）表达水平高于野生型小鼠（图4A-b），在MPTP诱导的PD小鼠中，活化的MMP-9和裂解的β-DG（p=0.0184）表达水平高于盐水处理组（图4C-E）。使用MMP-9抑制剂GM6001（100 mg/kg）治疗显著降低了MPTP诱导的PD小鼠中的前体MMP-9（p=0.0081）和活化的MMP-9水平（p=0.0097）（图4C-E）。这表明MMP-9介导了PD小鼠模型中的β-DG切割过程。此外，免疫荧光证实，与生理盐水组和MPTP+GM 6001组相比，MPTP+溶剂组中MMP-9增加，β-DG表达减少。免疫荧光显示，在MPTP+载体组中，MMP-9主要聚集在神经元内，并浸润星形胶质细胞终足包围的血管周围结构（图4F）。MMP-9的免疫反应性与β-DG含量的局部丢失有关（图4G）。

图 4

MMP-9抑制剂可恢复AQP4表达极性和血管周围基底膜-星形胶质细胞终足间的稳定性

既往文献表明，β-DG有助于AQP4在星形胶质细胞终足上的稳定（图5A）。免疫共沉淀法表明AQP4（AQP4-M1和AQP4-M23）与β-DG（43kDa）共沉淀，但不与IgG共沉淀（图5B）。作者使用了MM9-9抑制剂进一步评估MMP-9介导的β-DG切割在AQP4表达和定位中的作用。与MPTP+载体组相比，GM6001治疗后，AQP4-M1（p=0.0602）和AQP4-M23（p=0.0392）的表达水平上调，反应性星形胶质细胞标志物GFAP表达水平减弱（p=0.0106）（图4C-E）。此外，与MPTP+溶剂组相比，GM6001处理后，AQP4阳性（p=0.0029）和β-DG阳性（p=0.0037）细胞的数量增加，被标记的AQP4和β-DG阳性细胞数量沿血管周围区域均匀恢复（M1：p=0.0099；M2：p=0.0025）（图5C-D）。

裂解的β-DG由于失去了与细胞外α-DG的结合位点，导致星形胶质细胞终足在血管旁的基膜稀疏分布，通过透射电镜探索黑质中基膜-星形胶质细胞终足接触区的超微结构变化。与盐水组相比，MPTP+溶剂组中的星形胶质细胞终足严重肿胀、变圆，甚至与基膜分离，GM6001可重新恢复基膜与星形胶质细胞终足的接触。这些发现表明，MMP-9活性的增加裂解了血管周围的β-DG，导致AQP4去极化和星形胶质细胞终足在基膜处的稀疏分布，通过抑制MMP-9可逆转上述现象。此外，还进行了行为测试和TH免疫荧光研究，以验证增强的类淋巴系统功能（AQP4复极增强的过程）在PD病理学中的作用。与MPTP+载体组相比，GM6001治疗后未观察到明显的运动改善（p>0.05；补充图2A-B）；TH免疫荧光表明，黑质处TH阳性神经元的数量部分恢复（TH阳性神经元计数：MPTP+溶剂组：14±0.605，MPTP+GM6001：28.96±5.091，p=0.003；补充图2C-D）。

图 5

补充图 5

AQP4极性恢复减弱了MPTP诱导的代谢扰动

为进一步探索PD中类淋巴系统功能改变的潜在机制，进行了代谢组学分析（图6A）。PCA分析和PLS-DA分析均显示，MPTP+溶剂组和生理盐水组之间的代谢谱明显分离，AQP4极性恢复后代谢谱也恢复（图6B）。与生理盐水组相比，在MPTP+溶剂组中观察到136种上调和67种下调的代谢物（图6C），不同的代谢产物主要由脂质和类脂分子组成（28.723%），以及有机酸和衍生物组成（22.872%；图6D），AQP4极性恢复后，真皮层毒素、次级代谢产物和神经退行性变相关代谢产物下调，而多不饱和脂肪酸、核苷酸、磷酸甘油酯和其他生物合成中间体上调（图6E）。气泡图显示，AQP4极性的恢复与嘌呤代谢的调节有关（图6F）。

图 6

总结

CONCLUSION

AQP4去极化是造成PD患者免疫功能异常的关键因素。本研究表明，异常的MMP-9激活触发了β-DG切割，这是导致PD中AQP4去极化的分子机制。抑制MMP-9可恢复AQP4极性、促进基膜-星形胶质细胞终足的生理性接触，从而表现出神经保护作用和代谢稳态。因此，本研究提示抑制 MMP-9可能是增强帕金森病中类淋巴系统的潜在靶点。

原始文献：

Si X, Dai S, Fang Y, Tang J, Wang Z, Li Y, Song Z, Chen Y, Liu Y, Zhao G, Zhang B, Pu J. Matrix metalloproteinase-9 inhibition prevents aquaporin-4 depolarization-mediated glymphatic dysfunction in Parkinson's disease. J Adv Res. 2023 Mar 20:S2090-1232(23)00086-3. doi: 10.1016/j.jare.2023.03.004. Epub ahead of print. PMID: 36940850.

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编辑：Michel.米萱

校对：MiLu.米鹭