快速筛选TCR-pMHC相互作用的YAMTAD系统

个性化免疫治疗，如癌症疫苗和TCR-T疗法，需要快速筛选TCR-pMHC相互作用。这里介绍一种酵母凝集介导的TCR抗原发现系统(YAMTAD)，以允许快速和无偏倚地对TCR-pMHC相互作用进行筛选。在识别给定TCR的抗原和识别适度文库大小的给定pMHC的TCR方面实现了高灵敏度和特异性。最后，在文库对文库的筛选中，YAMTAD丰富了高亲和力的TCR-pMHC相互作用。YAMTAD的高通量(理论上为10^6-10^8×10^6-10^8)和简单性(无需纯化TCR和pMHC即可鉴定TCR-pMHC相互作用)，为TCR-pMHC相互作用的快速筛选提供了有效的平台，在未来的个性化免疫治疗中具有重要的应用价值。

一种产生高亲和力TCR的方法是噬菌体展示或酵母展示介导的TCR进化。酵母展示CDR3α突变文库已被成功应用于识别具有较低抗原输入的pMHC的高亲和力TCR。交叉反应和脱靶识别的风险随着亲和力的增加而增加。因此，评价高亲和力TCR的交叉反应性对TCR-T治疗的安全性至关重要。此外，癌细胞和病毒都会快速进化，以逃避高亲和力T细胞的清除。快速筛选多种免疫原性抗原和相关的TCR可以减少肿瘤或病毒对T细胞治疗产生耐药性的机会。

三种高通量发现T细胞抗原的方法：基于pMHC四聚体的筛选、基于细胞的筛选和基于酵母展示的筛选。DNA-Barcoded pMHC Tetramers for Detection of Single Antigen-Specific T Cells by Digital PCR四聚体方法使用DNA条码的pMHC多聚体来检测TCR的特异性。然而，pMHC四聚体需要关于抗原靶点的先验知识。此外，这些方法面临的挑战包括：低通量肽合成、pMHC多聚体生产效率低、pMHC多聚体不稳定、文库大小有限以及PCR扩增偏差。

这里是通过结合酵母展示和酵母交配来开发YAMTAD，以实现高亲和力的TCR-pMHC相互作用的文库对文库筛选。将TCR和pMHC盒整合到酵母基因组中提供组成型表达，并达到近乎完美的表面展示水平。设计了一种酵母T细胞共培养体系，以快速确认pMHC的功能，而不需要使用TCR四聚体。研究表明，YAMTAD系统可用来筛选多肽库和TCR库中实验证实的TCR和pMHC相互作用(868 TCR-SL9 HLA-A*02:01)，具有高的灵敏度和特异性。最后，证明YAMTAD可以在无偏倚库对库筛选中识别高亲和力的TCR-pMHC相互作用。

高通量筛选TCR-pMHC相互作用系统YAMTAD的设计

酵母展示可以达到10^8的文库大小，因此足以覆盖TCR和pMHC的整个序列空间。酵母交配系统以前被用于探测蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，因此是鉴定TCR-pMHC相互作用的理想方法。酵母凝集介导的TCR抗原发现系统(YAMTAD)是通过结合这些特征来高通量筛选TCR-pMHC相互作用的(图1)。

首先，TCR盒以报道的单链TCR(scTv)格式构建，其中TCR的可变域通过柔性连接子(Vβ-Linker-Vα，图1a上)连接。pMHC的特点是有一个与野生型β2M相连的N末端多肽库，紧随其后的是HLA重链(图1a下)。TCR和pMHC盒由构成GPD启动子(pGPD)驱动，与表位标签和Aga2p相连。基于这些盒可以产生TCR-CDR3突变体和pMHC-肽突变体。

其次，这两个构建物与交配类型特异性荧光报告基因分别整合到交配类型相反的酵母的基因组中，使用TRP1作为选择标记(图1b)。MATa酵母表达TCR-CDR3突变体和mCherry，并具有亮氨酸营养缺乏症标记。Matpha酵母表达pMHC-肽突变体和m绿松石，并具有赖氨酸营养缺陷性标记。赖氨酸和亮氨酸营养缺陷性互补标记可进一步用于二倍体选择。TCR和pMHC盒通过与组成型表达的Aga1蛋白结合而展示在酵母上。当两个单倍体细胞在完全培养基YPD中共培养22h后，与阴性对照相比，当表达在MATa酵母上的TCR识别在MATα酵母上表达的同源pMHC时，酵母之间的交配效率更高。

最后，用FACS或SC-Lys-Leu法筛选出具有双荧光的二倍体，并通过二代测序鉴定其中的多肽和TCR序列。对已确定的候选进行进一步验证。

图1：YAMTAD系统示意图。

高效显示基因组集成盒

使用两个先前已知的TCR-pMHC对来确定YAMTAD系统的效率。一是868 TCR，它识别与HLA-A*02:01结合的HIV-1 Gag抗原的9个aa序列(SL9，SLYNTVATL)。一是A6 TCR，它识别与HLA-A*02:01结合的HTLV-1抗原的9个aa序列(TAX，LLFGYPVYV)。

与以前的研究一致，将Aga2p融合的TCR和pMHC分别连接到pCTon2质粒上并展示在EBY100酵母菌株上，诱导22h后，70-80%的酵母细胞表面检测到TCR，而pMHC的最高展示效率仅为40-60%(图2a，c)。长时间的诱导不仅没有提高反而降低了展示效率，这可能是由于培养过程中质粒的损失(图2a，c)。因此，TCR和pMHC盒被集成到ySYNAGa和ySYNAGalpha的ARS314位中，以测试是否可以实现更高的显示效率(图1a)。TCR的显示效率显著提高到接近100%，并随着培养时间的延长保持稳定(图2b，c)。pMHC的显示效率也提高了~20%，但最高的效率仅在诱导4h后出现，随后下降(图2b，c)。另一对TCR-pMHC，即与H-2Ld结合的2C TCR-QL9(QLSPFPFDL)，也使用集成形式有效地显示，具有普适性。

TCR和pMHC的基因组整合和组成型表达显著提高了显示效率。

图2：组成型表达的TCR和pMHC实现了接近100%的显示效率。

酵母展示的TCR和pMHC具有功能

为了确定所展示的TCR是否具有功能，使用SL9-HLA-A*02:01四聚体(PE标记)对所展示的868 TCR进行染色。发现以整合形式表达的868 TCR有效地识别SL9-HLA-A*02:01四聚体(图2d)。使用抗2C-TCR抗体，还证实了2C TCR的正确折叠。

此外，设计了酵母T细胞共培养系统，以确认酵母展示的pMHC的功能(图2e)。与同源T细胞共同孵育20h后，用流式细胞仪检测T细胞早期活化标志CD69的表达。发现显示SL9-HLA-A*02:01和TAX-HLA-A*02:01的酵母可以激活同源T细胞(图2f)。此外，活化的T细胞比例与TCR-pMHC相互作用亲和力有关。低亲和力TCR，A6 TCR，被激活的水平低于高亲和力868 TCR(图2f)。这些结果表明，酵母T细胞共培养体系能够快速验证显示在酵母表面的pMHC的功能，而不需要纯化TCR四聚体，这是昂贵和耗时的。

以质粒形式表达SL9-HLA-A*02:01的酵母对868 T细胞有33%的激活作用。相比之下，整合的组成型表达形式激活868 T细胞中的75.6%。此外，当效应细胞(E)-T细胞/靶细胞(T)-pMHC-展示酵母细胞的比例为1:3时，T细胞的激活水平达到最高(下图)。这些结果表明，pMHC在酵母上的展示效率是影响T细胞活化的一个因素。因此，提高显示效率是YAMTAD系统在筛选TCR-pMHC相互作用时获得高灵敏度的关键，因为TCR-pMHC相互作用的亲和力低于其他类型的蛋白质-蛋白质相互作用。

显示在酵母表面的TCR和pMHC是否能模拟TCR-pMHC的特异性相互作用尚不清楚。通过优化初始OD、交配条件和培养基体积以增加附着时间，发现同源对之间依赖凝集的交配效率显著高于阴性对照对(图3a)。有趣的是，YAMTAD的结果显示，868TCR未能识别携带SL9的第三个aa突变为甘氨酸的3G突变体(图3a)。这一发现被酵母T细胞共培养系统进一步证实(图3d)。

图3：YAMTAD系统可用于筛选给定TCR的同源肽。

综上所述，成功地在酵母表面高效展示了功能性的TCR和pMHC，这使得YAMTAD系统能够检测TCR-pMHC的相互作用。

YAMTAD系统可用于筛选给定TCR的同源肽

为进一步测试YAMTAD系统是否可以用于在随机产生的肽库中筛选给定TCR的同源肽，构建了SL9肽第三个aa的各种突变体的随机文库，并将该文库转化到ySYNAGalpha菌株（下图）。将pMHC多肽突变体与表达868TCR或A6/2C TCR的MATa酵母杂交(图3b)。使用3*突变体作为标准化的内部对照，由于在SL9的第三个氨基酸中引入终止密码子而不被任何TCR识别，SL9、3F、3L、3H、3W、3Q和3K显著富集(图3c)，表明它们对868TCR具有较高的亲和力。

利用建立的酵母T细胞共培养体系，验证868 TCR能否识别该多肽。发现富集的SL9及其突变体3F、3L、3W和3Q可以激活868TCR，而3K不能激活868TCR(图3d)。在这些突变体中，SL9、3F、3L、3H和3W获得了较高的T细胞活性，这也与四聚体染色测定的较高亲和力有关，一种广泛用于亲和力评估的方法。激活值和KD值之间的差异可能是由于在酵母T细胞共培养系统中表面显示效率对T细胞激活的影响。为利用YAMTAD系统筛选TCR-pMHC相互作用文库，绘制ROC曲线以描述假阳性率(FPR)和真阳性率(TPR)之间的关系。在酵母T细胞共培养实验中，如果一种多肽平均能激活10%以上的T细胞，将其定义为同源多肽。ROC曲线表明，YAMTAD在筛选高亲和力TCR-pMHC相互作用方面可以达到令人满意的特异性和敏感性(图3e)。

然而，3I突变体激活了更高比例的T细胞，但在系统中没有检测到，可能是因为它在随机文库中的存在很低。虽然SL9和3F突变体的比例也很低，但它们对同源TCR的亲和力要高得多。3M和3V突变体激活的同源T细胞比例要低得多，而YAMTAD系统未能富集这些多肽。这些结果表明，YAMTAD系统检测TCR-pMHC相互作用的灵敏度受到随机库中多肽对的亲和力和比例的影响。

综上所述，结果表明，YAMTAD系统可以用于在非均匀分布的随机文库中筛选868 TCR的同源肽，具有高的特异性(85.8%)和敏感性(66.7%)，可用于评价TCR的交叉反应性。

YAMTAD系统可用于筛选给定肽的同源TCR

想知道该系统是否可以用于高亲和力TCR突变的筛选。构建了15株VαCDR3 868突变体，分别与表达SL9-HLA-A*02:01或TAX-HLA*02:01/SL9 3*-HLA-A*02:01的MATα酵母杂交。TAX-HLA-A*02:01和SL9 3*-HLA-A*02:01作为阴性对照(NCs)进行筛选，以排除噪声，获得真正相互作用的TCR-pMHC(图4a)。如前所述，使用带有终止密码子(GAHDY*LN)的VαCDR3突变体来执行标准化。以SL9/NC＞1和P值＜0.05的倍数变化为临界点，对阳性对照-868TCR和除GLHDYALN、GACDYALN和LAHDYALN以外的几乎所有VαCDR3突变体(图4a)进行了富集。

然后，通过使用SL9四聚体来确认相互作用，发现所有这些富含SL9的突变体都可以与SL9四聚体染色，这表明突变体可以识别SL9肽(图4b)。然而，未富集的突变体也可以被SL9四聚体染色，但似乎具有相对较低的MFI(图4b)，表明这三个突变体的亲和力相对较低。因此，YAMTAD系统具有筛选同源TCRs的潜力，具有较高的特异性，但敏感性(80%)有待提高。

图4：YAMTAD系统用于同源TCR筛选和库对库筛选。

YAMTAD系统可以扩展到文库对文库的筛选

为了进一步检验YAMTAD能否实现库对库无偏筛选，将TCR(868、A6和2C)和pMHC突变体(SL9、3L、3*、TAX和TAX 8*)以1：1的比例混合在一起。所有显示不同TCR和pMHC的酵母菌株都被随机DNA条形码标记。对于868、A6和2C TCR中的每一个，产生了两个具有不同条形码的菌株，以排除条形码之间可能的变异。通过在单倍体菌株中进行靶向扩增，然后进行Sanger测序，确定TCRs/pMHC序列与其标记条形码序列之间的匹配性。条形码标记的酵母的条形码序列如下图所示。MATa株表达Cre重组酶，MATα株表达β-雌二醇诱导转录因子ZEV4，激活Cre重组酶表达。交配后，在二倍体中用β-雌二醇诱导Cre重组酶的表达，使MATa菌株的loxp66和MATα的loxp71基因座发生重组，使来自两个交配菌株的两个条形码在同一染色体上的并列接合。使用特定的引物，两个条形码随后被同时扩增和测序(图4c)。

接下来，计算了与868/A6/2C TCR一起出现的每个肽突变的平均比例，然后根据TAX8*肽的比例进行归一化，将终止密码子引入到每组TAX的第八个氨基酸中。发现3L/SL9在868TCR组显著升高，而在A6或2C TCR组则不明显(图4d)。结果表明，在库对库筛选中，KD值为3.81nM(868TCR-SL9)和132nM(868TCR-3L)的高亲和力TCRpMHC相互作用可以得到富集。

为了进一步验证YAMTAD系统在大型文库对文库筛选中的灵敏度和特异性，将TAX8*、SL9和3L分别与其他阴性酵母(包括TAX和3*)以1:10^2和1:10^4的比例混合，生成合成文库。然后，在放大的交配体积中进行了YAMTAD筛选。计算了与868/A6/2C TCR一起出现的每个肽突变体的平均比例，并根据3*肽的比例进行了归一化处理，作为内部阴性对照，在SL9的第三个氨基酸上引入了一个终止密码子。发现在1:10^2和1:10^4(图4e，f)的稀释水平上，3L和SL9在868TCR组显著富集，而在A6或2C TCR组则不显著，这表明该系统可用于鉴定大型文库中TCR-pMHC的相互作用。

目前，YAMTAD系统寻找低亲和力相互作用的灵敏度是次优的。可能有三个因素起作用：a.由于TCR和pMHC之间的低亲和力而降低了交配效率；b.酵母表面展示的蛋白质的低稳定性；以及c.某些突变体可能在文库中的表达不足。需要进一步优化匹配条件，以提高系统的灵敏度。

Li, Y., et al. High-throughput screening of functional neo-antigens and their specific TCRs via the Jurkat reporter system combined with droplet microfluidics. 2023.02.20.529171. (2023).

Wang, L., Lan, X. Rapid screening of TCR-pMHC interactions by the YAMTAD system. Cell Discov 8, 30 (2022).

Dahotre SN, Chang YM, Romanov AM, Kwong GA. DNA-Barcoded pMHC Tetramers for Detection of Single Antigen-Specific T Cells by Digital PCR. Anal Chem. Feb 19;91(4):2695-2700. (2019)

Aggen, D. H. et al. Single-chain VαVβ T cell receptors function without mispairing with endogenous TCR chains. Gene Ther. 19, 365–374 (2012).

Gee, M. H. et al. Antigen identification for orphan T cell receptors expressed on tumor-infiltrating lymphocytes. Cell 172, 549–563.e16 (2018).

Moritz, A. et al. High-throughput peptide-MHC complex generation and kinetic screenings of TCRs with peptide-receptive HLA-A*02:01 molecules. Sci. Immunol. 4, eaav0860 (2019).

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