科研丨CLIN NUTR: 肠道菌群吲哚-3-丙酸介导益生菌摄入对健康老年人的神经保护作用

编译：微科盟煎蛋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

益生菌摄入对与年龄相关的脑功能衰退的有益作用先前已有文献报道；然而，肠道和大脑之间相互作用的机制联系尚未完全阐明。因此，本研究旨在通过临床试验和体外机理研究中的血液代谢组学分析来确定肠道微生物群衍生代谢物在肠-脑相互作用中的作用机制。在63名健康老年人(≥65岁)中进行了一项随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床试验。受试者服用安慰剂(安慰剂组，N = 31)或益生菌胶囊(Bifidobacterium bifidumBGN4和Bifidobacterium longumBORI；益生菌组，N = 32)，持续12周。然后在基线和试验结束时，使用1H核磁共振和液相色谱-质谱法对其血液样本进行全局和靶向代谢组学分析。使用16S rRNA基因测序方法进行肠道微生物分析。随后，在脂多糖刺激后，用吲哚-3-丙酸(IPA)体外处理小胶质细胞BV2细胞，用BV2细胞的条件培养基处理神经元SH-SY5Y细胞。最后，对BV2细胞中的促炎细胞因子和SH-SY5Y细胞中的神经营养因子的水平进行定量。结果表明，代谢组学分析显示，益生菌摄入显著改变了参与色氨酸代谢的代谢产物水平(P < 0.01)。在这些代谢物中，益生菌组肠道微生物群产生的IPA增加了1.91倍(P<0.05)，并与肠道细菌谱显著相关(P <0.01)。益生菌组IPA水平升高与血清脑源性神经营养因子(BDNF)水平呈正相关(r=0.28，P <0.05)，与安慰剂组相比呈相反趋势。此外，IPA(5 μM)的体外处理显著降低了活化小胶质细胞中促炎TNF-α的浓度(P <0.05)，用IPA处理的小胶质细胞的条件培养基培养的神经元细胞BDNF和神经生长因子的产生显著增加(P <0.05)。综上所述，本研究表明，肠道微生物群产生的IPA在保护小胶质细胞免受炎症，从而促进神经元功能方面发挥作用。因此，这表明IPA是将老年人肠道和大脑之间的相互作用与益生菌补充剂联系起来的重要介质。  

论文ID

原名：Gut microbiota indole-3-propionic acid mediates neuroprotective effect of probiotic consumption in healthy elderly: A randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter trial and in vitro study

译名：肠道菌群吲哚-3-丙酸介导益生菌摄入对健康老年人的神经保护作用

期刊：Clinical Nutrition

IF：7.643

发表时间：2023.5

通讯作者：Dong-Mi Shin

通讯作者单位：韩国首尔大学

DOI号：10.1016/j.clnu.2023.04.001

实验设计

结果

1 益生菌干预对健康老年人宿主代谢组的影响

本研究纳入了53名参与者(安慰剂组和益生菌组的平均年龄分别为72岁和71.11岁)(安慰剂组，N=26；益生菌组，N=27)，安慰剂组和益生菌组的24份和26份血清样本分别用于代谢组学分析(补充图1)。首先，我们进行了非靶向代谢组学分析，以提供益生菌干预引起的代谢变化的整体情况。血清代谢产物的全局图谱帮助确定了12种差异代谢物，包括参与芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)、甘氨酸和丝氨酸代谢(丝氨酸、甘氨酸、甜菜碱和甲硫氨酸)的代谢产物(图1A)。为了了解这些差异代谢物调控的代谢通路，我们对其中一组代谢物进行了通路富集分析。使用KEGG通路数据库，我们发现前5条通路，包括酪氨酸和色氨酸生物合成，以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，在服用益生菌的组中富集(图1B)。肠道菌群介导的色氨酸代谢相关通路在益生菌干预后显示出最显著的变化。因此，我们试图通过靶向代谢谱分析来确定色氨酸代谢中潜在的关键代谢产物。

值得注意的是，本研究发现，在服用益生菌的组中，肠道微生物群产生的代谢产物IPA(参与色氨酸代谢)显著增加(倍数变化=1.91，P <0.05，图1C)。我们还发现，受肠道微生物群影响的胆汁酸代谢中的代谢产物在益生菌组中发生了显著变化。例如，在接受益生菌的组中，鹅去氧胆酸(CDCA，一种初级胆汁酸)显著增加(倍数变化=2.18，P <0.05，补充图2)。此外，微生物群代谢的次级胆汁酸在益生菌组中显著增加：脱氧胆酸(DCA；倍数变化=1.51)、熊去氧胆酸(UDCA；倍数变化=1.51)和牛磺脱氧胆酸(TUCDA；倍数变化1.91)(均P <0.05，补充图2)。

图1. 益生菌干预对健康老年人宿主代谢组的影响。

(A)通过1H NMR测定血清样品的全局图谱。该热图显示了代谢物浓度的倍数变化，即各组干预前样品浓度与干预后(干预后/干预前)样品浓度之间的比值。在服用益生菌的组中，显著改变的代谢物用红色标记。(B)根据富集率从一组显著改变的代谢产物中选择前5个富集途径，该富集率是通过观察/预期命中率计算。(C)通过LC/MS确定色氨酸代谢中代谢物的靶向图谱。该轴显示代谢物浓度的log2(倍数变化)。基于Wilcoxon符号秩检验，*P ＜0.05。  

2 健康老年人益生菌干预后血清IPA水平升高与肠道细菌谱和血清脑源性神经营养因子有关

为了研究代谢物变化与肠道细菌谱之间的联系，我们对两者进行了相关性分析。胆汁酸代谢产物与肠道细菌谱之间没有显著相关性(数据未显示)。然而，在参与色氨酸代谢的代谢产物中，只有肠道微生物群产生的IPA与肠道细菌谱显示出显著相关性。在门水平上，Synergistetes和Tenericutes的相对丰度变化与IPA水平升高呈正相关(P <0.05，表1)。此外，我们确定了与IPA显著相关的前20个属(P<0.05，表2)，这表明在属水平上肠道细菌谱的变化与代谢变化显著相关。我们进一步研究了代谢特征和认知反应之间的联系，并对两者进行了相关性分析。图2中的热图显示了血清BDNF浓度变化与代谢产物之间的相关系数，BDNF是一种众所周知的认知功能标志物。值得注意的是，从色氨酸通路中的代谢物来看，益生菌干预后IPA水平升高与BDNF水平的变化呈正相关(r=0.28，P <0.05)，这与安慰剂组观察到的趋势相反。综上所述，本研究发现肠道微生物群代谢的IPA可能是肠-脑轴的靶分子，主要受益生菌干预的影响。

表1. 肠道菌群相对丰度与IPA浓度的相关性。(原文表2)

图2. 健康老年人肠道微生物群产生的IPA水平升高与脑源性神经营养因子之间的相关性。

热图表示Pearson相关分析的相关系数，该分析检测了各组代谢物变化与脑源性神经营养因子(BDNF)之间的相关性。与BDNF水平显著相关的代谢产物用红色标记。

3 肠道菌群产生的IPA对小胶质细胞具有抗炎作用

为了确定IPA是否是肠-脑相互作用的关键介质，我们研究了IPA在小胶质细胞中的神经保护作用，小胶质细胞负责局部损伤反应，如脑炎症，以及脑组织的维持。首先，我们使用MTT法测试了IPA的细胞毒性，结果表明，与未处理组相比，IPA对BV2细胞的毒性(在1 μM、2.5 μM、5 μM下)不显著(细胞活性>90%，P >0.05，图3A)。然而，与未处理组相比，浓度为10 μM时BV2细胞活力显著降低(69.35%对100%，P <0.05，图3A)。

接下来，我们评估了用不同浓度IPA (0 μM、2.5 μM、5 μM和10 μM)预处理6小时的细胞中促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)的mRNA和蛋白水平。与单独LPS处理组相比，IPA处理的BV2细胞中IL-1β的mRNA表达在LPS(50 ng/mL)处理24小时后显示出剂量依赖性降低(1 μM时−5.81%，2.5 μM时−12.93%，5 μM时−11.92%，10 μM时–29.23%；均P >0.05，图3B)，但TNF-α的mRNA表达没有显示出显著变化(图3C)。在蛋白质水平上，与单独LPS处理组相比，在2.5 μM和5 μM的IPA浓度下，IL-1β的浓度略有下降(2.5 μM时−5.28%，5 μM时−1.21%，均P>0.05，图3C)。此外，与单独LPS处理组相比，IPA处理的BV2细胞中TNF-α的浓度以剂量依赖性方式显著降低(1 μM时−7.66%，2.5 μM时–9.44%，5 μM时-10.55%，10 μM时-17.34%；所有P <0.05，图3D)。因此，这些结果表明，IPA通过抑制小胶质细胞中TNF-α的产生而表现出抗炎作用。

图3. 肠道微生物群产生的IPA对小胶质细胞的抗炎作用。

(A)检测IPA(0 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM和10 μM)对BV2细胞的细胞毒性。*基于ANOVA和Dunnett多重比较分析，P <0.05(与未处理组相比)。(B–C)评估BV2细胞中促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)的相对表达水平，并与未处理组进行比较。(D–E)在BV2细胞中检测促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)的浓度。#基于ANOVA和Tukey的多重比较分析，P <0.05(与无处理组相比)和*P<0.05(与单独LPS处理组相比)。数据表示为平均值±标准误差。缩写：IPA，吲哚-3-丙酸；IL-1β，白细胞介素-1β；LPS，脂多糖；TNF-α，肿瘤坏死因子-α。  

4 肠道菌群产生的IPA通过调节小胶质细胞-神经元相互作用产生神经保护作用

接下来，我们验证了我们的假设，即IPA的抗炎作用如何对神经元产生神经保护作用。基于细胞毒性试验的结果和不同浓度IPA的抗炎作用，用5 μM的IPA制备条件培养基。如图4A所示，将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞在该培养基中孵育24小时，然后检测神经营养因子(包括BDNF和NGF)的mRNA水平，以评估IPA对SH-SY5Y细胞的神经保护作用。与单独LPS处理组相比，IPA处理的条件培养基中BDNF和NGF的mRNA水平分别增加了46.12%和37.94%(P <0.05，图4B)。综上所述，这些结果表明，先前研究中发现的益生菌干预后大脑功能的增强是由肠道微生物群产生的IPA通过调节小胶质细胞-神经元相互作用产生的神经保护作用介导的。

图4. 肠道微生物群产生的IPA通过调节小胶质细胞-神经元相互作用产生神经保护作用。

(A)条件培养基的实验方案。(B)评估SH-SY5Y细胞中BDNF和NGF的相对表达水平，并与未处理组进行比较。基于方差分析和Tukey多重比较分析，*P <0.05，*** P <0.0005和**** P <0.0001。NS表示差异无统计学意义。数据表示为平均值±标准误差。缩写：BDNF，脑源性神经营养因子；IPA，吲哚-3-丙酸；LPS，脂多糖；NGF，神经生长因子。

讨论

1 主要结果

肠道细菌代谢产物作为肠道微生物群和大脑相互作用的主要介质发挥着关键作用。我们之前的研究发现，益生菌干预通过调节肠道微生物群来改善与年龄相关的脑功能衰退；因此，我们检测了食用益生菌对肠-脑相互作用的调节是否可能受益于细菌代谢产物的变化。本研究的主要发现是，对健康老年人的益生菌干预提高了肠道微生物衍生的IPA水平，IPA通过调节小胶质细胞BV2细胞中的炎症信号发挥神经保护作用。

2 IPA在肠道微生物群调节中的作用

众所周知，IPA对肠道微生物群有积极影响。例如，Zhao等人研究指出，IPA可降低HFD诱导的大鼠肠道生态失调，并且IPA对肠道微生物群的有益作用是通过减少内毒素(脂多糖)的产生和内毒素衍生的NF-κB信号活化来介导的。此外，IPA已被证明对广谱分枝杆菌具有抗生素活性，这表明它可以调节肠道微生物组成。与这些发现一致，本研究表明益生菌处理后IPA水平升高与肠道细菌谱的变化有关。例如，我们发现Tenericutes门和Mollicutes RF39属的种群数量随着IPA水平的增加而增加。此外，Eggerthella的丰度已被证明在多发性硬化症中通过肠-脑轴增加，显示出与IPA水平呈负相关。尽管由于缺乏16S rRNA数据的分辨率而未检测到产生IPA的菌株，但我们假设这些细菌在产生IPA细菌的肠道中繁殖。这可能部分是由于IPA水平升高，而IPA与肠上皮稳态密切相关，有助于肠道生态系统的整体改善。

3 IPA在神经炎症中的作用

双歧杆菌是研究最广泛的益生菌之一，与肠-脑轴的调节有关。特别是，本研究中使用的双歧杆菌菌株(B. bifidumBGN4 和B. longum BORI)在体外研究中显示对免疫细胞具有免疫调节作用，并抑制婴儿湿疹和成人肠易激综合征的过敏反应。这些结果表明，BGN4和BORI在与肠-脑轴相关的炎症途径中具有调节作用；这促使我们研究它们调节肠-脑轴的潜力和潜在机制。

肠道中的色氨酸代谢主要通过三种途径发生：血清素(5-羟色胺)途径、犬尿氨酸途径或转化为吲哚及其衍生物。色氨酸衍生的每种途径和生物活性分子对宿主的生理学都有独特的意义。有研究报告了吲哚衍生物IPA的抗氧化特性和化学伴侣活性。此外，IPA似乎随着年龄的增长而减少，这表明它可能在与年龄有关的疾病中发挥作用。正如我们的研究结果所证明的那样，本研究中老年人的血浆IPA浓度是健康年轻人的十分之一(0.09 μM vs 0.92 μM)。本研究还证明，在益生菌干预下，老年人的IPA水平增加(1.91倍变化)，与大脑功能的改善有关。基于这些观察结果，我们进一步研究了肠道微生物群产生的IPA是否对肠-脑轴有影响。IPA是一种以神经调节特性为特征的信号分子，最近受到了人们的关注：有证据表明其对淀粉样蛋白β(Aβ)原纤维形成的保护作用，在阿尔茨海默病的进行性致病事件中损害并杀死神经元。此外，一项体外研究表明，在IPA存在时Aβ原纤维形成减少约50%。此外，在接受抗生素处理的小鼠中，IPA给药降低了星形胶质细胞(大脑中参与神经元传递和免疫应答的最丰富的细胞类型)中Ccl2(一种促炎细胞因子)的表达，这表明IPA影响星形胶质细胞介导的神经炎症。与星形胶质细胞一样，小胶质细胞在中枢神经系统的免疫反应中也起着重要作用。IPA在小胶质细胞介导的免疫应答中的调节作用尚不完全清楚；然而，本研究发现IPA处理的小胶质细胞的条件培养基通过抑制小胶质细胞促炎因子的产生，对神经细胞中神经保护性BDNF和NGF的产生具有有益的影响。这些结果表明，食用益生菌后IPA水平的增加有助于通过调节小胶质细胞介导的炎症来避免神经元的功能丧失，从而改善健康老年人的认知功能和精神压力。

4 神经保护作用的机制

神经营养因子，包括BDNF和NGF，调节神经元的存活、发育、功能和可塑性。BDNF和NGF都以自分泌和旁分泌方式保护神经元，这表明神经元细胞中BDNF和NGF表达的增加可以保护自身和周围神经元免受活化小胶质细胞引起的炎症刺激。越来越多的证据支持BDNF参与神经炎症和认知障碍；因此，已经尝试通过饮食和体育锻炼增强BDNF来改善认知功能，作为阿尔茨海默病和轻度认知障碍的治疗靶点。经过16周的体育锻炼干预，轻度认知障碍的老年人外周BDNF水平增加，促炎细胞因子减少。此外，NGF已被证明通过引导小胶质细胞向抗炎表型发展来发挥神经保护作用。一项体外研究表明，NGF的抗炎作用可有效逆转淀粉样蛋白-β肽引发的小胶质细胞的促炎状态，这是众所周知的阿尔茨海默病的体外模型。这些结果支持了我们关于IPA的抗炎作用如何通过增加神经元细胞中的神经营养因子而发挥神经保护作用的发现。

本研究还发现，益生菌干预改变了参与胆汁酸代谢的代谢物。初级胆汁酸分泌到肠道，微生物群将其转化为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸和熊去氧胆酸(UDCA)。这些次级胆汁酸穿过血脑屏障，进而影响大脑的生理机能。在本研究中，益生菌干预增加了UDCA；在体外研究中，UDCA也被证明通过减少细胞凋亡来保护脑内皮细胞。此外，我们发现牛磺酸去氧胆酸(TUDCA)的水平也随着益生菌干预而增加，TUDCA是一种由肠道微生物群代谢的牛磺酸结合形式的UDCA。已经证明，TUDCA具有神经保护作用，可以减少小鼠小胶质细胞的神经炎症。因此，肠道微生物群-大脑相互作用所涉及的多种代谢途径表明，益生菌在脑功能中的调节作用似乎有更复杂的生物学机制。

5 优势和局限性

本研究的局限性包括，由于缺乏16S rRNA数据的分辨率，它无法提供对肠道微生物谱的功能见解。因此，未来使用鸟枪法测序分析的研究需要进一步探索。此外，我们关于IPA神经保护作用的体外研究结果需要在动物和临床研究中进一步评估。据我们所知，尽管存在这些局限性，但这是第一项提供证据支持益生菌干预提高的肠道微生物衍生IPA通过调节小胶质细胞-神经元相互作用具有神经保护作用的研究，从而充当肠-脑轴交流的纽带。这些结果还表明，用IPA进行饮食干预或用益生菌补充剂靶向肠道微生物群可能有助于预防与年龄相关的脑部疾病。

结论

本研究描述了益生菌补充剂通过改变肠道菌群来改善老年人认知的机制之一。本研究结果表明，IPA介导肠道和大脑之间的相互作用，当益生菌添加到饮食中时，代谢物通过调节小胶质细胞中的炎症信号对神经元具有抗炎保护作用。因此，这些结果有助于预防和治疗精神疾病，因为它们可以帮助寻找可用于此类目的的生物标志物。