四代基因测序技术揭秘！

来源：贾半仙聊诊断

基因测序，即通过对生物体的核酸序列进行检测，从而在分子和基因层面实现对生物体的进阶分析与解读。对于人类而言，究其根本都含有23对染色体、2.5万个基因编码、30亿个碱基对组成的bio-data综合体。通过对基因层面的解析，我们得以高效的探究自己身体内终极密码。

基因测序最初走进大众视线，凭借的是名人效应。乔布斯曾经花费10万美元进行癌症全基因组测序技术，在获得了个人基因组的信息后，医生为他开出相对精准的抗癌方案，使其面对胰腺癌这个“癌中之王”又带病生存了近10年。著名影星安吉丽娜朱莉通过基因检测了解到自己有87%的乳腺癌患病概率后，毅然选择了预防性手术。

现如今，基因测序不再是少数精英阶层的专利，技术的快速迭代、测序成本的持续降低将这项技术带到普通人的身边。

全球疫情的元凶SRAS-CoV-2病毒也是通过NGS技术而被中国科学家率先确定。在收到最初的病例标本后，国内几家病毒专业研究实验室平行开展了全基因组测序，均发现送检样本中存在同一种新的未知的冠状病毒基因组序列，该冠状病毒序列为主要病毒序列，且该基因组序列在健康人群和其他类型的肺炎患者中不存在，NGS技术为确定病原迈出了关键的一步。

测序仪器为什么是行业的“兵家必争之地”

测序是解开人类生物密码的基础，也是生命科学发展的基石。现在的测序技术已经应用到医疗检测，指导临床，寻找与疾病相关的基因突变信息等方面。测序领域发展迅速，其应用前景十分广阔，市场价值不可小觑。

随着高通量测序成本快速降低和生命科学领域的快速发展，高通量测序越来越多与各个学科交叉发挥出特有的作用。

目前产业下游逐步成熟的应用领域包括：多组学研究、人群队列基因测序计划、新药研发与创新、微生物检测、无创产前检测、肿瘤基因检测、辅助生殖等。

中国目前的测序应用以无创产前检测、肿瘤伴随诊断为主，随着技术逐步成熟，其余的应用方向比如肿瘤早筛、植入前胚胎遗传学、遗传病诊断将为行业提供持久的增长驱动力。

但从产业链的角度分析，我们会发现情况并不乐观。基因检测产业链分为上中下三个环节：上游主要负责测序仪的研发，核心技术掌握在Illumina、华大等少数几个大企业手中，呈现出垄断的态势；在整个基因测序的产业链中，上游技术要求最高，原因在于上游端测序平台需要掌握的核心技术包括 DNA 聚合酶、DNA 提取富集技术、光电技术等，因其整体性和复杂性形成技术壁垒。因此基因测序产业链上游的企业相对较少，市场份额集中。

2019 年全球基因测序上游市场份额（%）

中游提供检测+生物信息分析的测序服务，如诺禾致源、安诺优达等等一众公司，提供测序服务的门槛并不高，目前中游公司数量最多，竞争激烈，但拥有注册证产品的公司较少；下游临床、科研等终端用户。

目前五花八门的基因测序产品，主要围绕在产业链中下游，在已有的基因测序仪的应用层面展开激烈的市场竞争。而真正的行业命脉是上游市场，极高的技术壁垒，成为众多中下游基因测序企业的发展痛点，大家肯定会记得当年华大被卡脖子，后来发愤图强的往事。

国内外基因测序市场正以前所未有的速度增长着，各种基因测序产品和服务层出不穷。然而基因测序的高度专业性，决定了技术壁垒将始终是行业痛点，缺少核心技术的国内基因检测企业，绕不开技术的引进和同质化产品的竞争。

走出基因测序产业下游的竞争红海（典型的如诺禾致源，各位看官可自行搜索），引领技术革新是关键。所以测序仪器是行业玩家的命脉，想要在未来占据主动权，必须要拿下这颗“皇冠上的明珠”。

接下来让我们简要回顾一下测序技术的发展。

测序技术的前世今生

近半世纪以来，基因测序技术飞速发展，从一代发展至四代，发生了日新月异的变化：

第一代测序

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解），为方便起见，统称为Sanger法。在1977年，Sanger测定了第一个基因组序列——噬菌体phiX-174，全长只有5,375个碱基。

虽然与今日的技术比起来根本不算什么，但自此之后，人类获得了窥探生命本质的能力，并以此为开端真正步入了基因组学时代。Sanger法的核心原理请自我学习，本文不再赘述。

总的来说，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1,000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本偏高（相对基因组大小），通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是理想的测序方法。

第二代测序

二代测序技术在大幅提高了测序速度的同时，还大大地降低了测序成本，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但其序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。

目前illumina的测序仪占全球75%以上，以NextSeq、HiSeq、NovaSeq等系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，读长短（50-300bp）；准确度达99.9%；通量很高。

此外还有如日中天的华大智造，大家可以自行搜索招股说明书一探究竟。

但是第二代基因测序技术的局限性也显而易见：一是需要分子扩增，二是使用光学系统检测，三是必须有足够多的样本才能降低测序成本，这些部分限制了基因测序的推广，阻碍其走向产品和服务的基因消费时代。

但其技术硬伤还在于：1、读长短的缺点导致测序过程中含量较少的序列信息可能会丢失，且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基；2、想要得到准确和长度较长的拼接结果，需要测序的覆盖率较高，导致结果错误较多和成本增加。

第三代测序

以PacBio公司的SMRT单分子测序技术为代表。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，是二代测序技术的100倍以上。这种纳米孔单分子测序仪还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但这么快的测序速度也带来了一些明显的缺点——测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），可以达到10%-15%，而且以随机的缺失序列和错位居多。

总之三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，此外单样本的测序成本一直居高不下。

第四代测序

以Oxford Nanopore Technologies为代表的纳米孔测序技术与其他测序技术不同的是，它基于电信号而不是光信号。经历了三个主要的技术革新：一、单分子DNA从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。

将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔（直径2.6nm），只能容纳一个核苷酸通过，并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，从而进行实时测序，最终得到DNA分子的序列。

Oxford Nanopore的特点是单分子测序，测序读长长（超过150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等，但其单芯片测序成本还是在几百美金以上。

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