科研丨广东省人民医院: 比较宏基因组分析评估肠道微生物组失调对心脏手术相关急性肾损伤的影响(国人佳作)

编译：微科盟可爱多，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   心脏手术相关急性肾损伤(CSA-AKI)是一种常见的医院获得性AKI，具有严重的疾病负担。近年来，肠道-肾脏相互作用极大地改变了人们对肾脏疾病发病机制的理解。然而，肠道微生物失调与CSA-AKI之间的关系尚不清楚。本研究旨在调查CSA-AKI患者肠道微生物群改变的可能影响。将接受心脏手术的患者分为急性肾损伤(AKI)组和Non_AKI组。手术前采集粪便样本，进行鸟枪宏基因组测序以确定肠道微生物组的分类组成。采用α-和β-多样性分析对所有组别进行统计学比较，并进行LEfSe分析。本研究共纳入70名受试者，包括35名AKI和35名Non_AKI。AKI组和Non_AKI组在Shannon、Simpson或Chao1指数的α多样性和β多样性方面没有显著差异，但在功能通路方面存在显著差异(p < 0.05)。然而，CSA-AKI组前10个肠道微生物群的相对丰度与Non_AKI组不同。有趣的是，LEfSe和多变量分析都证实了大肠杆菌、Rothia mucilaginosa和Clostridium innocuum与CSA-AKI有关。此外，相关性热图显示，通路改变和功能破坏可能归因于涉及大肠杆菌的肠道菌群紊乱。综上所述，术前粪便肠道微生物群失调会影响CSA-AKI的易感性，这表明关键微生物在CSA-AKI的发展中起着至关重要的作用。本研究为进一步研究肠道菌群在CSA-AKI中的作用提供了有价值的知识。    

论文ID

原名：Evaluation of the contribution of gut microbiome dysbiosis to cardiac surgery-associated acute kidney injury by comparative metagenome analysis

译名：比较宏基因组分析评估肠道微生物组失调对心脏手术相关急性肾损伤的影响

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2023.3

通讯作者：陈寄梅，陈纯波

通讯作者单位：广东省人民医院(广东省医学科学院)

DOI号：10.3389/fmicb.2023.1119959

实验设计

结果

1 心脏手术患者的人口统计学特征

在本研究中，在2020年11月至2022年8月期间，70名接受心脏手术的患者来自中国不同地区的两个大型医疗中心(32名来自广东省人民医院，38名来自茂名市人民医院)。患者的基本情况如表1所示。两组在大多数基线特征(如人口统计学、临床病史)上无显著差异。CSA-AKI患者年龄大于Non_AKI组。对于心脏手术，体外循环时间和手术时间都会增加术后并发症的发生率，这与其他非心脏手术不同。CSA-AKI组患者胆红素和白细胞(WBC)水平明显升高。 表1 所有患者的人口统计学和基线特征。

2 CSA-AKI患者肠道微生物群特征

对术前粪便样本进行宏基因组测序，以确定肠道微生物群与CSA-AKI之间的关系。在去除未注释的微生物群后，在70个粪便样本中共鉴定出72个科水平、189个属水平和604个种水平肠道微生物群。为了评估两组间微生物组成和功能的总体多样性，我们在科、属、种和通路的水平上进行了Shannon、Simpson和Chao1指数的α多样性分析(图1)和PCoA的β多样性分析。AKI组和Non_AKI组在科水平(补充图S1A)、属水平(补充表S1B)或种水平(图1A)上Shannon指数的α多样性没有显著差异。虽然AKI组Simpson和Chao1指数的α多样性在不同程度上高于Non_AKI组，但没有显著差异(p > 0.05)，表明接受CSA-AKI的患者术前肠道微生物群的多样性相似。然而，AKI组肠道菌群功能通路的α多样性显著高于Non_AKI组(p < 0.05)(图1D)。基于PcoA的β-多样性分析，除了通路水平(p < 0.05)(图2D)，两组之间似乎在任何水平上都没有显著差异(图2A-C)。

图1 AKI组和Non_AKI组肠道微生物群α-多样性的比较。根据物种水平的Shannon指数(A)、Simpson指数(B)、Chao1指数(C)和功能通路水平的Shannon指数(D)测定肠道微生物群α-多样性。统计显著性阈值：p = 0.05。*表示P<0.05。    

图2 Non_AKI组和AKI组之间使用PCoA的β-多样性比较。(A)科水平，(B)属水平，(C)种水平，(D)通路水平。统计显著性阈值：p = 0.05。 

3 CSA-AKI和Non_AKI组top 10肠道菌群相对丰度的差异

进一步分析了AKI组和Non_AKI组之间肠道微生物群组成的差异。选择分类水平上丰度最高的前10个肠道微生物群，生成相对丰度累积直方图(图3和补充表S1)。不同水平前10个微生物所占比例差异较大，其中前10名属、种所占比例均大于50%。在科水平上，Bacteroidaceae、Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的丰度最高，而Enterobacteriaceae、Enterococcaceae和Tannerellaceae在AKI组中的比例远高于Non_AKI组(图3A)。在前10个属和物种中，分别属于Bacteroides、Prevotella和Faecalibacterium的Bacteroides vulgatus、Faecalibacterium prausnitzii和Prevotella copri在Non_AKI组中丰度最高。图3B显示，Escherichia、Enterococcus和Parabacteroides在AKI组中显著富集。与Non_AKI组相比，在种水平上，除了Escherichia coli和Parabacteroides distasonis外，Bacteroides dynorei在AKI组中也更为普遍，而属于拟杆菌属的其他菌种在Non_AKI组中显著富集(图3C)。

图3 各组在科、属和种水平的Top 10微生物相对丰度直方图。(A)各组在科水平的top 10微生物相对丰度直方图。(B)各组在属水平的top 10微生物相对丰度直方图。(C)各组在种水平的top 10微生物相对丰度直方图。其他代表除前10名以外的所有其他微生物的相对丰度总和。 

4 与CSA-AKI相关的细菌物种鉴定

进一步进行LEfSe分析，以证实AKI和Non_AKI组在科、属和种水平上的粪便微生物群组成的显著差异，如图4所示。与Non_AKI组相比，在科水平上，AKI组中丰度增加的细菌富集于Streptococcaceae、Carnobacteriaceae、Micrococcaceae和Actinomycetaceae，而丰度减少的细菌富集在Erysipelotrichaceae(图4A)。在属水平上，AKI组中Streptococcus、Escherichia、Pseudoflavonifractor、Rothia、Granulicatella、Peptostreptococcus和Actinomyces的丰度显著增加，而Gemmiger、Erysipelatoclosdium、Coprococcus和Ruminococcus的丰度降低(图4B)。更具体地说，AKI组中Escherichia coli、Enterococcus gallinarum、Rothia mucilaginosa和Clostridium innocuum的丰度明显更高，而Non_AKI组患者中Prevotella sp. CAG: 1031、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. 57_20和Lactobacillus fermentum的丰度更高(图4C)。总体而言，LEfSe分析揭示了两组之间存在显著差异：特别是图4D、E显示，纲水平Bacilli、属水平Escherichia、种水平Escherichia coil和属水平Streptococcus在AKI组中富集程度更高，而属水平Ruminococcus、Coprococcus、Prevotella sp. CAG: 1031和Erysipelatoclostridium在Non_AKI组中富集程度更高。

此外，本研究还评估了四个不同菌种对CSA-AKI发展的贡献。经单变量分析，年龄、手术时间、白细胞、血红蛋白、Escherichia coli、Rothia mucilaginosa、Clostridium innocuum与CSA-AKI相关。多变量分析显示，Escherichia coli、Rothia mucilaginosa和Clostridium innocuum仍与CSA-AKI独立相关(分别为OR:0.549，95%CI [0.316-0.953]，p = 0.033; OR：5.054，95%CI [1.412–18.082]，p = 0.013; OR：3.356，95%CI [1.278–8.810]，p = 0.014)(表2)。

图4 通过线性判别分析(LDA)效应大小分析确定粪便微生物群组成的变化，LDA > 2.0，p < 0.05。AKI与Non_AKI在科水平(A)、属水平(B)、种水平(C)和总体水平(D)上的比较。(E)从LEfSe分析中获得的分类分支图。

表2 与CSA-AKI相关的因素。

5 CSA-AKI患者肠道微生物功能破坏

为了比较患者术前粪便中肠道微生物群的功能潜力，我们通过LEfSe和STAMP分析进一步研究了两组之间的通路差异(图5和补充表S2、S3)。总体而言，根据LEfSe分析(LDA > 2)，在AKI组中共鉴定了91条通路，在Non_AKI组中鉴定了29条通路。AKI组主要富集L-高丝氨酸和L-甲硫氨酸生物合成、S-腺苷-L-甲硫氨酸生物合成、棕榈酸生物合成、L-赖氨酸生物合成I、C4光合碳同化循环、甲基赤藓糖醇磷酸途径II和部分TCA循环(LDA > 2.6)，而淀粉降解V、腺苷核糖核苷酸从头生物合成、queuosine生物合成I(de novo)、腺嘌呤和腺苷补救III以及3-脱氢奎尼酸的分支酸生物合成在Non_AKI组中富集(LDA > 2.8)(图5A)。同样，STAMP结果显示，检测到87个差异通路，其中59个在AKI组，这与以前的分析略有不同，比例不同(图5B)。腺苷核糖核苷酸从头生物合成的途径(AKI组和Non_AKI组分别为1.19±0.30% vs. 1.38±0.34%，p = 0.019)、淀粉降解V(0.95 ± 0.35% vs. 1.17 ± 0.34%，p = 0.011)、腺嘌呤和腺苷补救III(1.00 ± 0.25% vs. 1.15 ± 0.30%，p = 0.030)、UDP-N-acetylmuramoyl-pentapeptide生物合成II(含赖氨酸)(0.98 ± 0.24% vs. 1.12 ± 0.23%，p = 0.018)、甲基赤藓糖醇磷酸途径II(0.56 ± 0.13% vs. 0.49 ± 0.14%，p = 0.020)、糖异生I (0.40 ± 0.10% vs. 0.33 ± 0.13%，p = 0.007)、S-腺苷-L-甲硫氨酸生物合成(0.33±0.14% vs. 0.21±0.12%，p＜0.001)和L-甲硫氨酸生物合成(0.33 ± 0.12% vs. 0.21 ± 0.12%，p < 0.001)在AKI组和Non_AKI组之间有显著差异。 此外，基于STAMP(图6和补充表S3)和LEfSe(补充图S2)的结果，对不同肠道菌群与不同功能通路之间的关系进行了分析。相关性热图显示，通路改变和功能破坏可归因于肠道微生物群的紊乱，包括Escherichia coli、Oscillibacter sp. 57_20、Corprococcus comes、Coprococcus catus、Enterococcus gallinarum、Clostridium innocuum和Lactobacillus fermentum等。

图5 AKI组和Non_AKI组之间的通路差异。(A) LEfSe分析(LDA > 2)；(B) STAMP分析。    

图6 热图显示了所有患者中不同肠道微生物物种与87种不同通路之间的关联(STAMP分析)。*p < 0.05，**p < 0.01。Cor. coef.，相关系数。  

6 宏基因组学数据中肠道微生物群与AKI临床参数的相关性

通过分析肠道微生物群与临床肾功能参数(包括血尿素氮、血清肌酐和胱抑素C)的相关性，以阐明不同水平的肠道微生物群在CSA-AKI患者中的作用。有趣的是，研究发现Sutterellaceae与BUN-pre (p < 0.01)和Scr-pre (p < 0.01)呈显著正相关，而Ruminococcaceae与术后指标(如BUN-d2、Cys-C-d1、Scr-d2和Scr-d1)呈正相关(图7)。此外，还有Saccharomycetaceae、Corynebacteriacea和Clostridiales Family XIII. Incertae Sedis与术前Cys-C-pre和Scr-pre肾功能指标呈负相关。在种水平上(补充图S3)，Sutterella parvirubra与BUN-pre(p < 0.01)、Scr-pre(p < 0.05)、Cys C-pre(p < 0.05)和Scr-d2(p < 0.01)呈正相关。而Clostridium perfringens与BUN-pre(p < 0.05)、Scr-pre(p < 0.05)和Scr-d2(p < 0.05)呈负相关。Ruminococcaceae bacterium D16和Parabacteroides sp. CAG:409在术后24 h与上述三项肾功能指标呈正相关，而Butyricicoccus pullicaecorum在术后24-48 h与上述三项指标呈负相关。

图7 热图显示了8个临床肾功能变量与CSA-AKI患者肠道微生物组中科水平微生物丰度之间的关系。*p < 0.05，**p < 0.01。Cor. coef.，相关系数；BUN-pre，术前血尿素氮；BUN-d1，术后第1天血尿素氮；BUN-d2，术后第2天血尿素氮；Scr-pre，术前血尿素氮；Scr-d1，术后第1天血尿素氮；Scr-d2，术后第2天的血尿素氮；Cys C-pre，术前血尿素氮；Cys C-d1，术后第1天血尿素氮。      

讨论

本研究基于宏基因组分析，发现CSA-AKI受术前肠道微生物群的显著影响，特别是Escherichia coli、Enterococcus gallinarum和Rothia mucilaginosa，这表明肠道微生物群在CSA-AKI的发展中发挥着关键作用。据我们所知，这项研究探索了肠道微生物群在早期识别肾损伤中的潜力，并首次提供了直接证据，证明肠道微生物群的术前表型可能会影响对CSA-AKI的易感性，这为在不久的将来临床转化肠道微生物群用于CSA-AKI铺平了道路。 肠道微生物群被认为是一个动态器官，与宿主保持持续的联系和共生，并介导对各种疾病的易感性。厚壁菌门和拟杆菌门占主导地位，占肠道菌群的90%，其次是放线菌门、变形菌门和疣微菌门。拟杆菌属是本研究中数量最多但变化最大的属，这与之前的报告一致。Bacteroides vulgatus在AKI组和Non_AKI组中均富集，而Bacteroides uniformis、Bacteroides plebeius和Bacteroides stercoris(Bacteroides dynorei除外)在后一组中显示出更高的丰度。据报道，Bacteroides vulgatus和Bacteroides dynorei在冠状动脉疾病患者中的丰度显著较低，并减轻了小鼠的动脉粥样硬化病变并抑制了炎症。在转移性黑色素瘤患者中，高丰度的Bacteroides dorei似乎增加了免疫相关不良事件的风险，并与腺苷代谢酶的能力有关，而Bacteroides vulgatus在低风险群体中占主导地位。这些结果表明，聚集在CSA-AKI患者中的Bacteroides dorei可能对肾脏有害，这与上述研究一致。进一步研究目标微生物群的干预和调控，包括单定殖，将更有助于解释这一发现。 LEfSe和多变量分析均显示，Escherichia coli、Rothia mucilaginosa和Clostridium innocuum与CSA-AKI独立相关，表明术前粪便微生物群的特征可能会影响对CSA-AKI的易感性。Escherichia coli是一种革兰氏阴性菌，是肠道中主要的需氧生物，具有共生菌和致病菌的特征。共生大肠杆菌位于大肠中，尤其是盲肠和结肠中，共生生态位的改变会导致共生菌株进化成致病状态。在接受心血管手术的患者队列中，与Non_AKI患者相比，大肠杆菌在CSA-AKI患者术前肠道微生物群中的物种水平显著增加，表明其在肾损伤中的关键微生物作用以及对CSA-AKI的潜在易感性。事实上，据报道，多种大肠杆菌可导致AKI和永久性肾衰竭。Samanta等人还发现，AKI可在低压缺氧下发生，并影响Escherichia coli、Bacteroidetes、Bifidobacterium和Salmonella的肠道微生物种群。这些结果加强了对大肠杆菌肠道微生物群与肾损伤之间相互作用的理解。值得注意的是，芳香族氨基酸，包括色氨酸和苯丙氨酸，与AKI相关，可被大肠杆菌进一步代谢，以介导宿主-微生物群相互作用。

Rothia mucilaginosa属于微球菌科，越来越多地被认为是一种主要影响免疫功能低下宿主的机会性病原体。有趣的是，尽管它被认为是人类口腔和上呼吸道正常菌群的一部分，但该物种很少在心脏移植的ESRD患者中报道，并显示出作为坏死性小肠结肠炎微生物生物标志物的潜力。据我们所知，在本研究中，大肠杆菌和Rothia mucilaginosa首次被确定为CSA-AKI患者术前粪便中的差异物种，其作为生物标志物的潜力仍有待进一步探索。 此外，在CSA-AKI患者中，Enterococcus gallinarum显著增加，而Prevotella sp. CAG: 1031在Non_AKI组中富集(LDA > 3)，这与之前的研究不同。造成差异的主要原因是，这些研究大多是在手术后用小鼠粪便进行的，而我们的研究是在手术前用人类粪便进行的。Enterococcus gallinarum是一种革兰氏阳性兼性厌氧细菌，能够引起医院血流感染。据报道，在长期透析患者中，Enterococcus gallinarum是一种常见的耐万古霉素肠球菌，占57.1%。此外，拟杆菌属的Prevotella sp. CAG: 1031的繁殖有助于降低体重和血糖水平，这似乎与我们的研究一致，并为其有益功能提供了基础，尽管尚未有研究证实Prevotella sp. CAG: 1031对肾脏疾病的良性作用。

伴随着肠道微生物组成的改变，我们发现了细菌通路功能的失调。L-高丝氨酸和L-甲硫氨酸生物合成的超通路在AKI组中占主导地位，而淀粉降解V和腺苷核糖核苷酸从头生物合成的超通路在Non_AKI组中富集。事实上，L-甲硫氨酸是一种必需氨基酸，与生物体中含硫化合物的代谢密切相关，而L-高丝氨酸是L-甲硫氨酸生物合成的中间体。限制含硫氨基酸的摄入似乎有助于肾脏保护和减轻缺血/再灌注损伤。更具体地说，大肠杆菌、Oscillibacter sp. 57_20、Corprococcus comes和Enterococcus gallinarum可能是通路改变和功能破坏的主要原因。此外，相关性分析显示，产丁酸菌Butyricicoccus pullicaecorum与术后肾损伤指标呈负相关，表明丁酸盐产生减少可能与CSA-AKI的发生密切相关。事实上，Butyricicoccus pullicaecorum可以减轻大鼠的结肠炎，增强上皮屏障功能，甚至被认为是炎症性肠病患者的一种很有前景的益生菌候选物。 本研究的主要局限性是样本量相对较小，只能代表一小部分CSA-AKI患者粪便微生物群的变化。需要大量的样本来验证当前的结果。另一个局限性是缺乏因果关系论证。虽然在AKI组和Non_AKI组之间发现了不同的肠道微生物群，但这种相关性并不意味着因果关系。

本研究表明，术前粪便微生物群特征可能会影响CSA-AKI的易感性，这在一定程度上意味着肠道菌群紊乱是AKI发生的重要因素之一。然而，这是单一细菌还是多种细菌的作用，以及菌群如何发挥作用，仍需进一步验证。