利用Single B方法快速制备高效BSA抗体对的策略

研究背景

残余牛血清白蛋白（BSA）含量检测是生物制品质量控制的一项重要指标，直接关系到生物制品的使用安全。世界卫生组织及世界各国药典对残余BSA含量均有严格限定。《中国药典》（三部）2020版规定，成品中牛血清白蛋白残留量不得>50ng/剂。因此，需要利用特异性好，灵敏度高的抗体建立一种简便、高效的牛血清白蛋白残留量检测方法。

科研痛点

牛血清广泛使用于生物制品研究、制备过程中，虽然在生产过程中经纯化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制剂成品中。在人体中，超过一定浓度的BSA易引起人的免疫病理反应，引起严重的副作用，影响生物制品的安全性。对BSA有更为严苛的控制标准，此前我们基于鼠抗开发平台开发出灵敏度为0.51ng/ml，可检测1.56-100ng/mL的BSA检测试剂盒。能满足现行药典规范BSA残留检测要求，并有了稳定的科研群体。但在后续的产品回访中，项目经理进一步了解了他们的项目对BSA残留其实有更为严苛的控制标准，只是苦于市售产品检测限以及灵敏度未能完全满足。我们技术团队深挖客户需求，结合最新推出的XtenTMMab兔单克隆抗体开发技术，为客户提供了一种全新、高效、高灵敏度的BSA检测解决方案。

全新解决方案

利用兔单B细胞抗体开发技术，从BSA免疫的兔外周血中，分离BSA特异性的单B细胞，通过PCR 扩增及测序分析， 获得多个特异性识别BSA蛋白的抗体。

本方案筛选的兔单抗较传统方法杂交瘤技术筛选的抗体及兔多抗的亲和力和特异性更高，具有灵敏度高、稳定性强的特点，检测范围为0.78-50ng/mL，为开发高灵敏度的BSA残留检测试剂盒奠定了坚实的基础。

图1 XtenTMMab兔单克隆抗体开发流程

01动物免疫及单B细胞分选

利用开发的快速免疫方法免疫新西兰大白兔，三免（Day21）血清效价大于128K，可以进行后续单B细胞流式分选。然后将从PBMC中分离筛选到的B细胞进行抗原特异性检测，阳性率大于60%。

抗原BSA

包被1ug/ml*100ul

2k4k8k16k32k64k128kPBS效价

三免血清效价4.323.323.262.982.531.851.160.03>128K

图2 BSA兔血清三免（Day21）效价检测结果

图3 单B细胞ELISA检测部分结果展示

02阳性抗体测序及序列分析

根据单B细胞ELISA检测结果，挑选12个克隆进行抗体基因测序及分析，12个克隆测序全部成功。

图4 抗体可变区基因分析结果

03重组兔抗表达及鉴定

将测序得到的12个抗体挑选10个，利用自主开发的XtenCHO系统进行重组表达，纯化后得到纯度高，亲和力好的重组兔单抗。10株重组兔单抗ELISA效价均大于1:1000000。

图5 重组兔抗SDS-PAGE检测结果

图6 纯化后重组兔抗ELISA检测结果

04BSA抗体对开发

将10株重组兔单抗进行方阵实验配对，得到多对灵敏度高的抗体对，优选其中一对, 标曲线性范围0.78-50ng/mL, R2=0.9992。

图7 BSA抗体对标准曲线

05抗BSA鼠单抗和兔单抗亲和力比较

为了了解不同方法制备抗体亲和力的差异，我们将BSA的兔单抗与之前自产的用传统杂交瘤制备的BSA鼠单抗进行了亲和力的测试。在此，我们利用OPENSPR将鼠单抗、兔单抗和BSA进行了亲和力检测，发现兔单抗的亲和力比鼠单抗高1-2个数量级。

ka(1/Ms)kd (1/s)KD (M)

BSA&兔抗3D5

2.21E+05

1.90E-05

8.61E-11

BSA&兔抗6B71.39E+057.49E-065.38E-11

BSA&鼠抗12.81E+041.39E-044.95E-09

BSA&鼠抗21.48E+052.02E-051.36E-10

剩余未分选的B细胞以及筛选阳性的其他单B细胞可以冻存，以便用于后续筛选其他应用需求的抗体。

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