磷酸化蛋白质的常用检测方法

蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation)是生物界最普遍也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰(Post-translational modifications, PTMs)。20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程，在细胞中，大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的。在人类基因组中大约有2%的基因编码了500种激酶和100种磷酸酶。蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节对许多生物的细胞功能起开关调控作用是种普遍的重要调节机制，因此蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的焦点之一。

蛋白质磷酸化的主要类型与功能

磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类，即：O-磷酸盐，N-磷酸盐，酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，羟脯氨酸或羟赖氨酸的磷酸化仍不清楚；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白质磷酸化具有以下功能：(1)磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐)，如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统(PIR)的组氨酸蛋白激酶(HPr)；(2)磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸酶(酪氨酸残基)；(3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。

常用的蛋白质磷酸化的检测方法

1 Western blot蛋白免疫印迹

蛋白质磷酸化作用可以通过Western blot利用抗磷酸化蛋白抗体进行检测。WB特异性好、分辨率高，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以一抗为探针，结合标记的二抗并以自显影或者底物显色来显示蛋白条带。凝胶由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。蛋白样品经过浓缩胶和分离胶后会以清晰的印迹按分子量大小依次上下排列于胶面上，然后将蛋白转移至PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)或NC膜(硝移纤维素膜)，蛋白会以非共价键的形式稳固地结合在载体上，选择对应的磷酸化抗体，发生抗原抗体反应，再与酌或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性磷酸化蛋白成分。但细胞中的磷酸化信号通常比较弱，需要经过磷酸化富集后 Western blot 才能检验到。

2 32P同位素放射性标记法

蛋白质磷酸化可以通过识别电泳凝胶上的同位素蛋白点来检测。用32P同位素放射性标记法，即体内代谢培养用32P同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有32P同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋白上，通过凝胶电泳分离，可以用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。但放射性标记只能在细胞中应用，比较局限目有放射性危险。

3 荧光染色法

可通过荧光染色试剂检测磷酸化位点中的酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸的磷酸化，主要用于信号转导中蛋白磷酸化的研究，可以直接用来染色磷酸化蛋白凝胶，同时可与质谱兼容，不妨碍随后蛋白质组中多种磷酸化分析研究。荧光染色试剂对高丰度且磷酸基团转化速率低的蛋白质具有较高的灵敏度，但对于不同的磷酸化位点，灵敏度差异较大。

4 流式细胞技术

流式细胞术采用荧光标记的单细胞悬液为检测样品，通过检测标记荧光的荧光强度来确定所检测细胞或细胞因子的浓度。应用流式细胞技术检测荧光标记的磷酸化蛋白质特异性抗体可以精确测量单细胞内的多参数磷酸化，可以同时在不同的细胞亚群中分析几种信号通路组成元件，大大提高了工作效率。研究人员可以根据需要分别检测各细胞亚群的磷酸化水平，从多层次探索信号转到机制，且可以同时分析多种参数之间的相互关系。但流式细胞技术检测需要特异性荧光染料，耗费高、仪器贵。

5 质谱分析法

运用质谱可以测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目及其位置，是一种可发现和鉴别翻译后修饰的方法。基于质谱的蛋白磷酸化分析包括：1.识别磷酸化多肽的存在；2.根据氨基酸序列确定磷酸化类型；3.确定磷酸化位点；4.定量确定蛋白磷酸化位点。蛋白磷酸化理论上都可以运用质谱检测，但质谱分析酶解磷酸化蛋白并不能检测全部蛋白序列，可能会有重要磷酸化区域被忽略，且细胞中磷酸化蛋白含量甚微，磷酸化肽段的信号容易被非磷酸化肽段的信号所抑制，所以有必要在质谱分析之前进行磷酸化蛋白和肽段的富集。

打赏