纳米抗体-酵母展示

以下文章来源于Of Studies ，作者HJhydrangea

Studies serve for delight, for ornament, and for ability. 读书足以怡情，足以傅彩，足以长才。 共勉。

分享一篇文章，介绍用于快速发现构象选择性纳米体的酵母表面展示平台。

Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies

内容摘要

Camelid single-domain antibody fragments (“nanobodies”)骆驼单域抗体片段（“纳米抗体”）在单个15 kDa免疫球蛋白VHH域内具有显著的抗体特异性。这一独特的功能使其应用范围从生化研发领域扩大到临床治疗。Nanobodies已成为蛋白质结构生物学中特别有用的工具，有助于研究构象动态蛋白质，如G蛋白偶联受体（GPCR）。迄今为止，几乎所有可用的纳米抗体都是通过动物免疫获得的，这一瓶颈（bottleneck）大大限制了纳米抗体的应用。为了解决这个问题，文章报道了一个基于酵母表面展示的完全体外纳米抗体发现平台（a fully in vitro platform ）。提供了识别纳米抗体的blueprint ，通过将纳米抗体与其抗原结晶（Crystallize）来证明文库的效用。

抗体由于其特殊的特异性和生化的多功能性，对科学和医学产生了变革性的影响，使其能够应用于生物医学研究的几乎每一个方面。传统抗体由两条重链和两条轻链组成。它们中的每一个都通过一个可变结构域(重链和轻链分别称为VH和VL)促进抗原结合的特异性。在骆驼类(大羊驼、骆驼、羊驼等驼类)中发现了一个例外，它们拥有完全由重链组成的平行抗体库。这种抗体通过一个可变结构域(VHH)与目标抗原结合，该结构域包含整个抗原结合表面。与传统抗体的抗原结合片段(Fab)不同，分离出的VHH结构域(也称为“纳米抗体”)可以作为单一基因的产物在细菌中表达，在许多情况下，这些结构域甚至可以在真核细胞质的还原环境中折叠并保持抗原特异性。由于其多功能性，纳米抗体已在蛋白质结构生物学和细胞生物学中得到应用，并作为潜在的诊断和治疗药物。

尽管纳米体在生物医学研究中越来越重要，但目前制造这些强大工具的方法仍然缓慢、昂贵，而且常常不可靠。迄今为止所描述的大多数纳米体都来自于免疫骆驼，这是一个漫长而昂贵的过程，对大多数实验室的进入构成了重大障碍。更重要的是，动物源性抗体往往由于自身抗原的免疫耐受而不能与保守的表位结合。由于保守的表位通常驱动蛋白质的关键功能，如蛋白质-蛋白质识别和变构交流，一种以这些位点为目标的快速识别纳米体的方法将提供一种强大的手段来询问蛋白质的功能。

先前试图通过结合噬菌体展示和合成文库来解决纳米抗体识别方面的挑战。然而，这些库仍然只能通过与昂贵的商业提供商签订合同来使用，这限制了它们的广泛使用。此外，有了合成库，识别不仅与目标抗原结合，而且还能识别特定构象的纳米抗体。噬菌体展示技术能够分离高亲和力的结合物，但是识别功能克隆(例如构象选择的纳米体)仍然具有挑战性。在这里，通过开发和应用完全合成的酵母显示纳米体库来解决这些挑战，该库使用来自蛋白质数据库(PDB)的结构特征纳米体排列设计。利用荧光激活细胞分选(FACS)支持的基于细胞的选择方案，可以直接和快速地识别两种人类GPCRs的构象选择纳米抗体。

首先设计了一个合成纳米抗体库（a synthetic nanobody library  ），从一个来源于llama genes IGHV1S1–S5.的共识框架开始。

这个恒定的框架区与互补决定环(CDR)的设计变化相结合，CDR构成了VHH的高度可变的抗原结合界面。对PDB中整套独特的纳米体(分析时为93条序列)在CDR中的位置特异性变化进行了分析，合成抗体库的设计旨在重现这种多样性。对于紧挨着CDR的残基，引入部分随机化（partial randomization ），只允许由PDB中观察到的纳米抗体频率引导的少数可能的氨基酸。对于每个CDR中高度可变的位置，引入更彻底的随机化（thorough randomization  ）来反映这些位置的高度多样性。首先，确定PDB中所有纳米抗体中CDR3中每个氨基酸的频率。合成的氨基酸混合物经过修饰以消除半胱氨酸（C）和蛋氨酸（M）以避免化学反应，并被引入到合成文库中每个CDR的不同位置。通过对纳米抗体序列的分析，选择在CDR1和CDR2中分别引入四个高度可变的位置。较长的CDR3代表了一个对抗原识别至关重要的Loop——在这里，引入7个、11个或15个连续的高度多样性混合物位置，以模拟在自然库中看到的CDR3长度变化(图1A - C)。

Figure 1. Design and construction of synthetic nanobody library

图1所示。合成纳米体库的设计与构建

(A)合成纳米体示意图。框架区域按顺序固定(灰色)，而CDR loops 的部分是不同的(CDR 1、2和3分别为蓝色、绿色和橙色)。混合核苷酸（mixed nucleotides ）实现了部分随机化，实现多达6个可能的氨基酸随机化(虚线，通过两个个简并碱基，实现A/D/G/N/S/T氨基酸随机化)，而高度可变的区域是使用三聚体磷酰胺混合物trimer phosphoramidite mixture 合成的(*星点轮廓)。

(B)显示三维结构的纳米抗体概述(插图)以及突出CDR loops.的卡通示意图。合成的CDR3序列使用了可变长度的三聚体磷酰胺混合物trimer phosphoramidite mixture ，随机生成7,11或15个氨基酸残基Residues 。

(C)文库构建完成后，通过下一代测序(NGS)分析CDR中不同位置的氨基酸频率，文库频率与目标值非常接近。

(D)酵母上展示纳米抗体Yeast surface display platform 。纳米抗体显示在羧基末端有一个HA标签，然后是一个长而灵活的柄a long flexible stalk ，共价将纳米抗体拴在酵母细胞壁（the yeast cell wall）上。

(E)纳米抗体筛选selection 过程示意图。抗原用荧光标记显示为发光的红色圆圈。显示与抗原有亲和力的纳米体的酵母是通过MACS或FACS分离，扩增，并经历迭代筛选轮。

合成了包含所需序列多样性的引物，使用trimer phosphoramidite mixture构建了高多样性区域，以匹配目标密码子频率。然后，通过这些引物的聚合酶链反应(assembly PCR)建立了一个汇集了纳米体完整序列的DNA文库。合成抗体片段的一个普遍但往往不被重视的缺点是较差的生化行为。在产生大型酵母显示文库之前，先需要评估文库设计是否能够可靠地产生适合于结构和细胞生物学研究的生物化学可处理的克隆。从文库中随机选择11条纳米体序列，通过表达和纯化从大肠杆菌中检测其生化行为。在这些克隆中，9个表达良好(>20 mg/L)，可以通过常规程序纯化，并显示合理的单分散尺寸排除谱(Supplementary Figure 1; Supplementary Table 1)

Supplementary Figure 1Biochemical validation of nanobody clones.(A – K) Randomly chosen nanobodies were expressed and purified from E. coli, then analyzed by size exclusion chromatography to assess monodispersity（单分散性）.从大肠杆菌中随机选择纳米抗体表达纯化，再用尺寸排除色谱法分析单分散性 。

 (L) SDS-PAGE analysis of nanobody purity following one-step nickel affinity purification（镍亲和纯化一步法）.

一步镍亲和纯化后的纳米抗体通过SDS-PAGE分析纯度。

体积排除色谱(size exclusion chromatography，SEC)，是色谱个分离模式中最简单、最单纯的一种类型。在排除色谱中，溶质即待测样品组分，与固定相或填料、流动相之间没有额外的相互作用。只依据分子的体积(流动力学体积)的大小而分离。

接下来，将纳米抗体和其他小蛋白固定在酿酒酵母和其他酵母物种的表面。此前已经报道了多种方法来实现这一目的，最常见的方法是将感兴趣的蛋白质与酵母细胞壁蛋白Aga2p融合。虽然这一策略已被广泛应用，但由于需要使用表达半乳糖诱导Agalp的工程酵母菌株，从而将Aga2固定在酵母细胞壁上，因此受到限制。取而代之的是，作者建立了一个简化的系统，在该系统中，the protein of interest目标蛋白通过单一的系索（a single tether ）直接连接到细胞壁，该系索（a single tether  ）旨在取代Aga2p-Agalp连接蛋白。设计了一种模拟酵母细胞壁蛋白低复杂度序列的合成tether ，并对其将测试蛋白固定在酵母细胞壁上的能力进行了评估。该蛋白的可及性与染色试剂的分子量密切相关，提示细胞壁聚糖的空间闭塞。与这一解释一致的是，较长的链系tethers缓解了这一问题，超过600个氨基酸的长度，染色水平的分子量依赖性可以忽略不计(Supplementary Figure 2)。

对于库的创建，选择使用649个氨基酸的系链。此外，我们加入了一种N端工程交配因子α前蛋白(N-terminal engineered mating factor αpre-protein )，该蛋白已被报道可增强酵母中的抗体表达。在C端，加入了一个糖基磷脂酰肌醇锚定序列，该序列可导致该蛋白以共价固定在酵母细胞壁上(Figure 1D)。

在此基础上，将工程表面展示质粒(pYDS649)线性化，将其与DNA文库一起转化到酿酒酵母蛋白酶缺失株BJ5465中，并扩增出与pYDS649同源的侧翼序列进行重组。这导致了5 × 108个转化体的产量。虽然与一些文库相比，这是适度的，但我们在下面展示了我们的方法产生的克隆与通过动物免疫获得的相似，证明了我们基于结构的文库设计的价值。为了鉴定得到的酵母表面展示文库，从-60万个酵母细胞中分离质粒DNA并进行高通量测序。对48万个独特序列的分析证实，文库克隆在CDR环的高可变部分具有所需的氨基酸频率(Figure 1C)，也证实了CDR-flanking区域的多样性与目标频率相似。总的来说，通过流式细胞仪检测，26%的文库酵母显示纳米抗体高表达。综上所述，这些数据意味着该文库包含至少10E8个独特的全长纳米体克隆，能够在酵母表面表达和显示。

Figure 2. Validation of nanobody platform using human serum albumin (HSA) as the target antigen.

以人血清白蛋白(HSA)为靶抗原的纳米抗体平台验证

(A)酵母文库HSA结合直方图，显示预筛选(黑色)和四轮后(蓝色)。HAS结合细胞的百分比显示。由Nb组成的总文库的比例。对B201进行深度测序，显示该克隆逐渐富集。

(B)尺寸排除色谱分析证实纯化的重组Nb.b201与HAS的结合。

(C)纳米体晶体结构:HSA复合物(PDB ID 5VNW)，包括CDR环与抗原相互作用的特写图。虚线表示氢键。

(D)复合物的旋转视图

(E)抗原结合状态(黄色)和无抗原状态(灰色)的纳米体结构比较;PDB ID 5VNV)，在与抗原结合时表现出构象变化。更改用箭头突出显示，对于CDR 1、2和3,CDR循环分别用蓝色、绿色和橙色表示。参见表1和补充图3。

Supplementary Figure 2 Design of display system.

(A) The display system was engineered using the high affinity SIRPα variant CV1 as a test protein, and its ligand CD47 ectodomain as the staining reagent. A biotin tag is schematized as a glowing red circle. (B) Length of the stalk region determines accessibility of a displayed protein as a function of molecular weight. (C) Analytical flow cytometry plots showing length dependence for two staining reagents: CD47 biotin and α-HA antibody. The 649 amino acid long stalk was used in all nanobody display experiments.

展示系统的设计

(A)以高亲和力SIRPα变体CV1为测试蛋白，其配体CD47外结构域为染色试剂，构建显示系统。Biotin生物素标签被图示为一个发光的红色圆圈。

(B)茎秆区域的长度决定了显示蛋白质的可及性，与分子量有关。

(C)流式细胞仪分析图显示了两种染色试剂:CD47生物素和α-HA抗体的长度依赖性。649个氨基酸的长柄被用于所有的纳米抗体展示实验。

Supplementary Figure 3Analysis of HSA-targeted nanobodies. 

(A) Library design was assessed by monitoring the change in amino acid frequency in CDR3 throughout selection rounds with HSA as the antigen. Few changes were observed, with the only notable trend a modest increase in basic residue frequency and a decline in acidic residue frequency. (B) Assessment of Nb.b201 binding to human serum albumin by surface plasmon resonance, comparison with mouse serum albumin which shows no detectable binding. (C) 2Fo-Fc composite omit map contoured at 1.5 σ for antigen bound Nb.b201. The structure of both bound (yellow) and free (gray) forms of the nanobody are shown, highlighting structural divergence. (D) 2Fo-Fc composite omit map contoured at 1.5 σ for free Nb.b201.

靶向HSA纳米抗体的分析。

 (A)文库设计通过监测以HSA为抗原的CDR3在整个筛选轮中氨基酸频率的变化来评估。变化不大，唯一显著的趋势是碱性残基频率略有增加，酸性残基频率有所下降。

 (B) Nb.b201的评估。B201通过表面等离子体共振与人血清白蛋白结合，与小鼠血清白蛋白比较，未发现结合。

 (C)抗原结合Nb.b201的2Fo-Fc复合缺失图谱绘制于1.5 σ 。纳米体的结合形式(黄色)和自由形式(灰色)的结构都显示了出来，突出了结构上的分歧。

 (D)自由Nb.b201的2Fo-Fc复合材料在1.5 σ下的omit map。

作为最初的测试，以人类血清白蛋白(HSA)为抗原，筛选能够与之特异性结合的纳米抗体，HSA是人类血浆中最丰富的蛋白质。治疗蛋白和小分子与HSA的结合是药物药代动力学的关键决定因素;因此，靶向HSA的纳米体可能提供了一种模块化工具，以提高生物的半衰期。在第一次测试中，使用了磁细胞分选(MACS)，这是一种低成本的细胞分离方法，即使在最基本的实验室环境中也可以进行，不需要专门的设备。

为了识别新的HSA结合纳米体，首先制备了荧光标记的HSA蛋白，然后使用它进行迭代染色和基于磁珠的富集。简而言之，这种方法需要用荧光HSA抗原孵育酵母文库，洗去多余的抗原，然后用抗荧光团磁性微珠进一步对所需克隆进行染色。标记细胞通过磁分离分离，在标准酵母培养基中扩增(Figure 1E)。与任何基于文库的选择一样，最重要的是确保binders识别抗原本身，而不是用于分离的试剂或荧光标记。为了达到这种特异性，在每个选择步骤之前，酵母与beads单反应从文库中被耗尽。为了降低荧光团结合剂富集的可能性，所使用的荧光团标签在Alexa Fluor 647和荧光素异硫氰酸酯(FITC)之间交替进行连续的每轮magnetic selection。

经过4轮筛选(Figure 2A)，分离出单个酵母菌落，用荧光标记的HSA染色，用分析流式细胞术验证。为了进一步研究，选择了一个具有较强抗原结合能力的克隆Nb.b201进行深入研究。

正如所料, Nb.b201可以用标准方法从大肠杆菌中表达和纯化，每升培养物的纯化蛋白产量为26 mg。通过分析尺寸排除色谱(Figure 2B)和表面等离子体共振(SPR，Supplementary Figure 3)更定量地评估了HSA的体外结合。两种技术都证实了Nb.b201的特异性结合。Nb.b201具有高度的特异性，显示不与密切相关的小鼠血清白蛋白结合(MSA，Supplementary Figure 3)，而在430nm处Nb.b201结合亲和力较低。并通过size exclusion chromatography评估与HSA形成稳定的复合物(Figure 2B)。

评估

Nb.b201与HSA结合的结构基础。Nb.b201在分离时和与HSA复合时都容易结晶。x射线数据收集X-ray data collection得到的数据集对自由纳米体和HSA复合物的分辨率分别为1.4 Å and 2.6 Å(Table 1)。这些晶体结构揭示了Nb.b201采用了之前观察到的动物源纳米体典型的v型免疫球蛋白折叠(Figure 2C – E)。两种结构的比较为比较同一抗体片段的结合状态和自由状态提供了机会。值得注意的是, Nb.b201在与抗原结合时发生了大规模的构象变化，导致CDR3主链和氨基酸侧链的重定向(Figure 2E)。抗原识别模式涉及Nb.b201主要通过其CDR3 loop与靶标结合，HSA与CDR1或CDR2的直接接触相对较少。有趣的是，Nbb201识别的表位是HSA表面的凸出表位，而大多数纳米表位通常是凹面的。相互作用模式包括极性和非极性相互作用的混合，反复出现Tyr-Glu和Tyr-Asp hydrogen bonds（氢键） (Figure 2C)。这些结果不仅揭示了合成纳米抗体-抗原相互作用的机制，而且也证实了在2 - 3周内可以获得用于晶体学的有用纳米抗体，而无需使用专门的设备或大型动物免疫。

Supplementary Figure 4

Figure S4 | Discovery of nanobodies with non-purified antigen.

A) Conditioned medium containing adiponectin (left lane) was used for selection of nanobodies. It shows a complex mixture of proteins as assessed by SDS-PAGE. For reference, purified adiponectin is shown in the right lane. Adiponectin exists as a mix of 16-mers, hexamers, and trimers. (B) Schematic of selection process. Fluorescent anti-FLAG antibody was used to specifically mark those yeast cells that display adiponectin-binding nanobodies. (C) Flow cytometry analysis of final clone pool, showing that the library was highly enriched in adiponectin-binding clones. (D) Sequences of five selected clones showed highly diverse CDR3 sequence composition and length. (E) Binding assessed using in vitro pull-down with purified adiponectin globular domain. (F) Binding to adiponectin was further confirmed in vitro using surface plasmon resonance. Kinetic fit is shown for clone Nb.AQ103.

A)使用含有脂联素的条件培养基(左道)来选择纳米体。SDS-PAGE显示了复杂的蛋白质混合物。为参考，纯化后的脂联素显示在右侧。脂联素是16-聚体、六聚体和三聚体的混合物。

(B)筛选过程示意图。荧光抗Flag抗体用于特异性标记那些显示脂联素结合纳米体的酵母细胞。

(C)最终克隆库的流式细胞仪分析显示，文库富含脂联素结合克隆。

(D) 5个克隆的CDR3序列组成和长度差异较大。

(E)使用体外下拉法评估与纯化的脂联素球状结构域的结合。(F)体外通过表面等离子体共振进一步证实了与脂联素的结合。显示了克隆Nb.AQ103的动力学拟合。

酵母或噬菌体表面展示文库的选择通常是用纯化和标记的蛋白质样品进行的。由于蛋白质纯化的特殊性，表面展示技术一直是蛋白质工程的关键瓶颈。这一屏障对于低表达蛋白(如膜蛋白和广泛的翻译后修饰蛋白激素)来说尤其明显。

代谢激素脂联素metabolic hormone adiponectin，这是一种具有许多翻译后修饰的复杂蛋白，只能在真核细胞中表达，通常产量很低。将标记有氨基末端FLAG表位的人脂联素作为分泌蛋白在HEK293细胞中表达，得到的含有复杂蛋白混合物的培养基作为选择抗原(Supplementary Figure 4A,B)。

表达纳米体的酵母与含脂联素的条件培养基孵育，清洗，然后用荧光标记的抗Flag M1抗体染色。在经过三轮MACS和荧光激活细胞分选后，通过SPR确认了三个独特克隆的脂联素结合(Figure S4C)。像这样的方法可能使生化方法无法鉴定的人类蛋白质组的大部分快速试剂开发成为可能。

GPCRs是人类最大的跨膜受体家族，在中枢神经系统功能、代谢调节和心血管生物学等生理机能的各个方面发挥着重要作用。纳米抗体已被证明是GPCRs详细结构和生化表征的宝贵工具。例如，一种稳定β2肾上腺素能受体(B2AR)活性构象的驼胺基纳米体Nb80可以确定激素激活的GPCR4活性构象的第一个x射线晶体结构。随后，Nb80的构象选择性也被用于探索活性B2AR在活细胞中的定位，从而揭示了细胞内GPCR信号转导的新范式3。另一个纳米体Nb35有助于研究异源三聚体G蛋白G与B2AR复合物的结构和信号，从而确定了GPCR-G蛋白异源三聚体复合物的第一个结构20。近年来，与gpcr结合的纳米体已经扩展到包括一系GPCRs6。然而，迄今为止报道的所有靶向gpcr的纳米体都可以追溯到动物免疫——这是一种缓慢、昂贵且常常不成功的技术。

Figure 3. Structural and functional modulator nanobodies targeting a GPCR.

靶向GPCR的结构和功能调制器纳米体

(A) β2肾上腺素能受体在无活性构象群(红色)和活性构象群(绿色)之间的相互转化。受体的活性状态可以通过与受体细胞内表面结合的纳米体(黄色)来稳定。

(B)流式细胞仪图中总结的选择结果。经过FACS选择后，大量克隆(23.6%)显示激动剂特异性结合B2AR。

(C)主动态稳定纳米体隔离的选择示意图。在MACS轮(1、2和5)中，依次进行耗尽和富集步骤。在FACS轮中，双色分选被用来富集激动剂特异性克隆，同时耗尽拮抗剂特异性和非选择性克隆。

(D) B2AR构象选择性克隆序列分析，显示高度分化的CDR3序列。

(E)纳米盘中的放射配基竞争结合证实了合成纳米体稳定活性态构象B2AR。数据以平均值+/- SEM的形式显示，在三个重复实验中进行。

(F)单循环SPR实验，测量了Nb的亲和力和动力学。c200与B2AR BI167107结合。红色为实验数据，黑色为曲线拟合。(G)表面等离子体共振测量的纳米体亲和力总结(参见补充图5)。h金属离子亲和层析固定的c200拉下纯化的β2AR晶体试验之前。(i)Nb。使用脂质立方相法，c200使β2AR结晶。(J) cAMP信号分析法测定合成纳米体存在或不存在时β2AR信号。在三个重复实验中，数据以平均+/−SEM表示。参见补充图4。

鉴于构象选择性抗体在GPCR研究中的广泛应用，任何旨在取代基于免疫的方法的体外平台必须能够生成构象选择性GPCR结合物。因此，作者试图利用合成的纳米体库平台来识别选择性结合B2AR活性构象的纳米体(Figure 3)。首先选择纳米体展示酵母通过MACS结合纯化的、Flag标记的B2AR与激动剂BI167107结合。随后，我们引入了一种反选择策略来消除不需要的克隆，包括与M1抗体本身结合的纳米小体、Alexa Fluor 647荧光团、构象不变的表位或不活性的B2AR构象。例如，在第三轮MACS中，首先耗尽了与高亲和力拮抗剂carazolol占据的B2AR结合的克隆，然后富集了与激动剂占据的受体结合的克隆。为了富集所需的激动剂结合B2AR特异性纳米体，进行了两轮FACS。在这里，酵母文库与B2AR占用的激动剂(BI167107)和拮抗剂(carazolol)同时孵育，每个受体配体复合物都标记有特定的Alexa荧光团(Figure 3A – C)。这种使用FACS的专门选择需要一个基于细胞的显示系统。作为选择的克隆与所需的表位结合的标志，大部分克隆与Nb6B9竞争，Nb80先前的亲和成熟变体，以高亲和力结合β2AR 21的细胞内侧。最后，通过降低激动剂结合β2AR浓度的MACS来富集亲和性最高的克隆。

对单个克隆进行测序发现，分离出了13个独特的结合激动剂占用β2AR的纳米抗体(Figure 3D; Supplementary Figure 5)。进一步利用酵母滴定法对克隆进行优先排序，结果表明，分离出的纳米体在低至中纳米摩尔范围内对β2AR-BI167107复合物具有一系列亲和力。预计从这个库中识别的构象选择性纳米体将在生化、结构和细胞生物学应用中找到效用。因此，接下来在药理、晶体学和细胞信号实验中验证了活性状态特异性β2AR纳米体。选择4个克隆进行进一步鉴定，并从大肠杆菌中表达和纯化。通过竞争放射配体结合试验评估，4个纳米体均增加了β2AR的激动剂亲和力(图3E)。该金标准药理学分析为每个纳米体稳定B2AR的活性构象提供了明确的证据。接下来，我们使用单循环动力学方法，通过表面等离子体共振(SPR)测定了每个纳米体与bi167107占β2AR的结合亲和性(Figure 3F, G)。测量的亲和性范围为44 nM到151 nM，与研究最广泛的大鼠衍生的gpcr靶向纳米体Nb80相比，其结合亲和性约为140 nM 。

接下来，测试了这种构象稳定性是否足以使激动剂结合的β2AR结晶。可能是由于激动剂结合状态的构象动力学，之前所有结晶β2AR-BI167107复合物的尝试都失败了，因为没有细胞内结合纳米体或异源三聚体G蛋白。

此外，评估了我们合成的纳米体在活细胞中调节GPCR信号的潜力，这是羊驼衍生纳米体的一个关键应用。与羊驼衍生纳米体一样，发现合成的纳米体在肾上腺素反应中可以显著削弱β2AR信号。在测试的纳米体中，发现Nbc203是最有效的，使肾上腺素Emax降低45%(Figure 3J)。观察到的最大信号抑制的变异性可能反映了细胞溶胶还原环境中纳米体的亲和力和稳定性。Nb的有效性。尽管C203的亲和力较低，但它强调了测试多个独特克隆对体内应用的重要性。值得注意的是，在这些纳米体存在下观察到的不可克服的抑制与纳米体的G蛋白竞争结合模式一致。与正位抑制剂不同，添加过多的激动剂不能克服纳米体抑制，因为结合位点是不同的。

Figure 4. Isolation and characterization of agonist-bound-A2AR specific nanobodies

图4 激动剂结合A2AR特异性纳米体的分离和表征

(A)构象选择性纳米体的FACS富集。

(B)对单个克隆进行染色和流动分析，以特异性识别激动剂UK 432097结合的A2AR。在脱靶象限的低频率事件可能来自于与基本活性受体分子的非特异性结合和弱结合。

(C) Nb的UK 432097或拮抗剂ZM 241385结合受体的酵母结合。AD101和Nb。AD102表达酵母。

(D)Nb.AD101 (Lane 2)和Nb.AD102 (Lane 3)纯化，具有UK 432097结合的AzAR或ZM 241385结合的A2AR (Lane 4和5)。

为了进一步研究合成纳米抗体库的通用性，试图识别另一个GPCR的构象选择性纳米体。作为实验案例，选择了人类A2A腺苷受体(A2AR)。这种受体在中枢神经系统中起着重要作用，这一点早已为人所知，最近又成为癌症免疫治疗药物开发的靶点。重要的是，虽然已经报道了一种非活性状态特异性Fab，但并没有针对A2AR的活性状态选择性纳米体。为了生成活性状态特异性纳米体克隆，进行了两轮MACS来生成A2AR结合纳米体库，然后进行一轮FACS来丰富构象选择性结合剂(Figure 4A)。从这个池中，有两个的克隆体Nb.AD101和AD102。选择AD102进行进一步表征。在流式细胞仪结合试验中，每个克隆都表现出对激动剂结合A2AR的强烈偏好(Figure 4B)。为了进一步验证这些克隆，我们表达并纯化了它们，并在体外下拉试验中测量了它们与受体的结合。与基于细胞的染色实验一致，这些纳米小体显示出只与激动剂占用受体结合(Figure 4C)，证实了该方法的通用性。

Taken together，总之，这些数据表明，我们体外平台识别的构象选择性纳米体再现了羊驼来源克隆的所有关键特征。此外，从合成文库中识别出的大量构象选择性克隆的多样性可能使更大的应用程序集成为可能;有些可能作为晶体学伴侣表现得更好，有些可能在细胞内还原环境中更稳定，而有些可能在复杂环境中识别特定蛋白质所需的特异性增加。

Supplementary Figure 5 Affinity of β2AR binding nanobodies. On-yeast titration to estimate affinity of β2AR binding nanobodies. EC50 values are summarized in the lower right. Bottom panel shows measurement of conformational selectivity for selected clones as assessed by flow cytometry.

β2AR结合纳米体的亲和力。酵母上滴定法评估β2AR结合纳米体的亲和力。右下角总结了EC50值。底部面板显示通过流式细胞术评估的选定克隆的构象选择性测量。

Nanobody Library Selection by MACS

讨论

来自骆驼重链抗体的纳米抗体已经成为特别强大的研究工具，这在很大程度上是因为它们能够检测和稳定GPCRs和其他具有生物化学挑战性的蛋白质的特定构象。然而，尽管纳米体具有广泛的用途，但由于与纳米体发现相关的挑战，纳米体仅被用于潜在应用的子集。其中最重要的是对骆驼、大羊驼或羊驼的免疫要求——这是一个缓慢而昂贵的过程，需要大量纯化蛋白质，并需要获得大型畜牧和兽医设施。此外，这一过程通常只能产生少量的纳米抗体克隆体，其中许多或所有的克隆体可能不具备所需的活性。作者在此报道的方法解决了这些挑战，提供了一个基于酿酒酵母上展示的工程库的纳米抗体筛选的完全体外平台。

为了评估合成库的效用，选择了针对不同抗原阵列的纳米体:可溶性蛋白、非纯化蛋白和两种人类GPCRs(G蛋白偶联受体，一大类膜蛋白受体的统称)。在每一种情况下，合成库都能够鉴定出具有所需活性的与目标抗原结合的纳米体克隆。迄今为止，利用该文库进行的所有纳米抗体筛选工作已经成功地分离出具有亚微摩尔亲和力sub-micromolar affinity 的克隆。值得注意的是，文章的筛选方法中添加了FACS富集，合成的β2AR结合克隆的亲和力与最广泛研究的gpcr靶向纳米体(羊驼衍生的Nb80)相当，甚至更好。

结合磁珠和FACS富集提供了一种对特定目标或特定构象选择性的纳米体识别的快速方法。早期的MACS轮可以耗尽大量的非绑定克隆，快速地将库的多样性减少两到三个数量级。然而，基于Macs的反选择策略精度较差，并且针对目标或构象状态的克隆识别通常需要多次迭代才能充分富集。考虑到现代FACS仪器的流率（throughput），作者选择在选择方案的早期尽可能利用基于荧光的选择提供的精度，通常在两轮磁分选之后，以减少库的多样性到一个可管理的水平。虽然这种方法可能会错过文库中亲和力最高的单个克隆，但纳米抗体很容易通过亲和力成熟来提高亲和力，即使是对GPCRs21这样的困难靶点。

重要的是，合成文库生成的纳米体粘合剂易于结晶和随后的结构确定，显示了作为一种辅助结构研究的工具的可观的前景。从可溶性蛋白结合剂到构象选择性GPCR稳定剂，合成抗体文库可以直接、快速、低成本地分离具有高度专业化功能的纳米抗体。

原文链接：McMahon C, Baier AS, Pascolutti R, Wegrecki M, Zheng S, Ong JX, Erlandson SC, Hilger D, Rasmussen SGF, Ring AM, Manglik A, Kruse AC. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6. Epub 2018 Feb 12. PMID: 29434346; PMCID: PMC5839991.