科研丨中大＆解放军疾控中心: 住院COVID-19患者的口咽微生物群失调和抗生素耐药性(国人佳作)

编译：微科盟Sky蓝

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)大流行正在进行，多项研究已经阐明了其发病机制，但SARS-CoV-2引起的相关微生物组失衡仍不明确。本研究通过宏转录组测序全面比较了健康对照和中度或重度症状COVID-19患者口咽拭子中的微生物组成和相关功能变化。本研究发现，与健康对照组相比，COVID-19患者的微生物群α多样性降低，但机会性微生物显著富集，并且在COVID-19患者康复后重建了微生物稳态。相应地，在COVID-19患者中也观察到多个生物过程中的功能基因较少，碳水化合物代谢、能量代谢等代谢途径减弱。本研究仅发现重度患者和中度患者之间有限属(如Lachnoanaerobaculum)的相对丰度较高，而没有观察到值得注意的微生物群多样性和功能改变。最后，研究人员注意到抗生素耐药性和毒力的共存与SRAS-CoV-2引起的微生物组改变密切相关。总体而言，本研究结果表明，微生物生态失调可能会增强SARS-CoV-2的发病机制，应谨慎考虑使用抗生素治疗。

论文ID

原名：Dysbiosis of oropharyngeal microbiome and antibiotic resistance in hospitalized COVID-19 patients

译名：住院COVID-19患者的口咽微生物群失调和抗生素耐药性

期刊：Journal of Medical Virology

IF：20.693

发表时间：2023.4

通讯作者：罗欢乐，舒跃龙，常国辉

通讯作者单位：中山大学公共卫生学院(深圳)；解放军疾病预防控制中心

DOI号：10.1002/jmv.28727

实验设计

结果

1COVID-19患者的微生物组成发生变化

为了探究SARS-CoV-2引起的上呼吸道微生物组变化，我们对30例中度COVID-19患者、28例重度COVID-19患者和24例年龄和生物性别匹配的健康对照组的口咽拭子进行了宏转录组测序(图1A ,表S1)。在这个队列中，多名患者接受了抗生素治疗。然而，由于抗生素的使用不影响PCoA的微生物组成，因此在接下来的比较分析中没有对抗生素的使用进行调整(图S1)。结果发现，在该队列的健康对照和COVID-19患者中，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和螺旋体门(Spirochaetes)是最主要的五个菌门。在这些菌门中，与健康对照组相比，COVID-19患者中拟杆菌门的相对丰度显著降低，而梭杆菌门和螺旋体门的相对丰度较高(图1B)。此外，这三个门中丰度前10的微生物属组成显示，二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和Tannerella是COVID-19患者拟杆菌门丰度降低的原因，而梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)是COVID-19患者梭杆菌门丰度升高的原因，Treponema、Sphaerochaeta是COVID-19患者螺旋体门丰度升高的原因(图S2)。然而，中度患者和重度患者在门水平上的相对丰度没有显著差异(图1B)。此外，我们分析了该队列中前45个微生物属的组成。与健康对照组相比，COVID-19患者中大多数属包括Leptotrichia、Lautropia、Treponema、Fusobacterium和其他21个属的相对丰度显著升高，而Prevotella、Capnocytophaga、Tannerella的相对丰度则有所下降。与健康对照组相比，中度COVID-19患者卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和棒状杆菌属(Corynebacterium)的相对丰度显著升高，而重度COVID-19患者的韦荣氏球菌属(Veillonella)和Gorganvirus的相对丰度升高，链球菌属(Streptococcus)的相对丰度降低。值得注意的是，我们发现重度COVID-19患者中Lachnoanaerobaculum丰度高于中度COVID-19患者。

图1. 健康对照和COVID-19患者口咽拭子微生物组的鉴定。

(A)宏转录组测序的研究设计。该队列包括健康对照组、中度COVID-19患者和重度COVID-19患者。

(B)微生物组成的前15个门。健康对照组与COVID-19患者差异显著的前3个菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和螺旋体门(Spirochaetes)，已在图中框出。其余的门保留为“其他”。(C)微生物组成的前45个属。与健康对照组相比，COVID-19患者共有25个属的相对丰度显著升高，3个属的相对丰度显著降低。颜色条代表每个微生物群的丰度值(%)。

2COVID-19患者上呼吸道菌群多样性发生改变

微生物群多样性可能在急性和慢性炎症中发挥作用，因此对COVID-19患者和健康对照组的呼吸道微生物群进行多样性分析。Alpha多样性分析表明，与健康对照组相比，COVID-19患者的物种多样性显著降低，但在中度和重度COVID-19患者之间未发现显著的物种多样性差异(图2A)。通过Beta多样性分析方法分析了种水平的微生物组成。如图2B所示，PCoA可视化中度和重度COVID-19患者口咽拭子的微生物组成与健康对照组相比显示出很大的离散性，表明SARS-CoV-2感染引起了微生物组成的分层，这一结果得到了PERMANOVA结果(F=6.2039, p=0.001)和ANOSIM结果(R=0.12, p=0.003)的支持。为了区分显著富集的微生物，我们在重度患者、中度患者和健康对照组之间进行了线性判别分析效应量(LEfSe)分析。对于条件致病菌，我们在中重度COVID-19患者中发现了较多的Leptotrichia wadei、Porphyromonas asaccharolytica、Ensifer sp. PDNC004，甚至是Legionella clemsonensis和Listeria innocua。与中度患者相比，重度患者中存在更多的Leptotrichia wadei和Streptococcus sp. HSISM1，而Vibrio rotiferianus在中度COVID-19患者中呈现更高水平(图S3)。总体而言，这些结果表明SARS-CoV-2感染导致多种条件致病菌数量增加，而物种多样性显著降低。

图2. 健康对照和COVID-19患者口咽拭子微生物多样性和组成。

(A) Shannon-Wiener指数估算的Alpha多样性。

(B)使用基于Bray-Curtis的PCoA分析了Beta多样性，显示物种结构组成的差异。椭圆表示95%的置信区间。

(C、D)健康对照组与中度COVID-19患者(C)或健康对照组与重度COVID-19患者(D)之间的物种LEfSe分析。仅LDA>2且P<0.05的特征被纳入。

3COVID-19患者口咽拭子微生物稳态的变化

上述丰度变化结果表明，SARS-CoV-2感染扰乱了微生物稳态。因此，我们想知道在患者康复后，细菌组成是否恢复。为了回答这个问题，本研究分析了5例患者在康复期间两次采集的口咽拭子的微生物组成，两次采集间隔时间为3-13天。5名患者康复后，多种共生细菌如Veillonella dispar、Neisseria mucosa、Neisseria flavescens增加，而几种致病菌如Campylobacter concisus、Haemophilus parainfluenzae、Burkholderia contaminans和Leptotrichia wadei减少。总体而言，COVID-19患者康复后，微生物组的稳态平衡趋于重建(图3)。  

图3. 5名患者康复阶段两次样本中前20种物种的相对丰度变化。条形图上方所示的时间长度表示康复期间两次采样之间的时间间隔(3-13天)。

4COVID-19患者的微生物功能变化

为了更好地了解微生物组成失衡对功能特征的影响，我们通过COG功能注释和KEGG分析在健康对照组和中重度COVID-19患者中进一步探索了微生物组的生物学功能。重度患者与中度患者的功能基因富集无显著差异，但COVID-19患者在“细胞周期控制、细胞分裂、染色体分配”、“核苷酸转运和代谢”、“碳水化合物转运和代谢”、“翻译、核糖体结构和生物发生”、“细胞壁/膜/包膜生物发生”、“无机离子转运和代谢”等生物学过程中富集的功能基因的相对丰度显著低于健康对照组(图4A、图S4)。相应地，功能基因组成在COVID-19患者和健康对照组之间存在显著差异(Adonis分析[F=2.7668，p=0.047]和ANOSIM相似性分析[R=0.0559，p=0.021])，而中度COVID-19患者和重度COVID-19患者的功能基因结构相似(图4B)。KEGG分析表明，与健康对照组相比(图4C、图S5)，COVID-19患者碳水化合物代谢(糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢、原核生物中的固碳途径)、能量代谢(氧化磷酸化)、氨基酸和蛋白质代谢(核糖体、tRNA生物发生、RNA聚合酶、蛋白质输出)相关通路的相对丰度显著降低。值得注意的是，与中度COVID-19患者相比，重度COVID-19患者中柠檬酸循环、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、信使RNA生物发生等通路的相对丰度较低(图4D)。总体而言，这些数据表明SARS-CoV-2导致整个微生物群落的生命活动减少。

图4. 基于COG和KEGG注释的健康对照组和COVID-19患者口咽拭子微生物功能变化。

(A)堆叠条形图显示COG功能。星号表示在健康对照组和COVID-19患者之间存在显著差异的蛋白功能(p < 0.05)。

(B)基于Bray-Curtis距离的PCoA显示COG组成的差异。椭圆表示95%的置信区间。

(C)堆叠条形图显示前44条KEGG通路。其余功能保留为“其他”。星号表示健康对照组和COVID-19患者之间存在显著差异的通路(p < 0.05)。

(D)中度和重度COVID-19患者KEGG通路变化趋势。条形图显示重度和中度COVID-19患者前20条KEGG通路的变化趋势。M，中度COVID-19患者；S，重症COVID-19患者。

5COVID-19患者抗生素耐药性与毒力共存情况

在该队列中，62%的住院COVID-19患者根据医生的临床诊断接受了抗生素治疗，因此我们比较了抗生素治疗组[COVID-19 (ab+)组]和未治疗组[COVID-19 (ab-)组]之间的抗生素耐药基因(ARGs)和VFGs。本研究发现了17种ARGs，包括48种亚型，其中大环内酯类耐药基因、碳青霉烯类耐药基因、β-内酰胺类耐药基因和卡那霉素耐药基因位居前4位(图5A)。与COVID-19 (ab-)组相比，COVID-19 (ab+)组中ARGs的相对丰度显著增加，而COVID-19 (ab-)组的ARGs富集水平与健康对照组相似(图5B)。cfxA_gen、cfxA3和erm(X)等12种ARGs在COVID-19 (ab+)组中显著高于COVID-19 (ab-)组(Mann-Whitney U检验，p < 0.05)。接下来，我们分析了在COVID-19患者和健康对照组中发现的12种VFs和31种VFGs。荚膜、脂寡糖(LOS)和肺炎球菌表面蛋白A (PspA)是相对丰度较高的主要VFs (图5C)。COVID-19患者VFGs总相对丰度显著高于健康对照组。值得注意的是，COVID-19 (ab+)组中VFGs的平均相对丰度是COVID-19 (ab-)组的2.73倍(图5D)。与COVID-19 (ab-)组相比，RbexC'、ctrD、galE等10种VFGs在COVID-19 (ab+)组中显著富集(Mann-Whitney U检验, p < 0.05)。

基于spearman分析(p < 0.05)，进一步构建了由54个菌属、36个ARGs和30个VFGs组成的网络。具体而言，在前100个显著相关性(r > 0.5)中，ARGs (如tet(M)、catB8、aph(3”)-Ib、ant(3'')-IIa、blaOXA-66、sul1和aac(3)-Ia)与VFGs (如fimB、llpxA、rfaD、rffG、galE、manB/yhxB和galU)之间存在较强的相关性，表明该队列中ARGs和VFs多重共存(图6)。有趣的是，我们发现COVID-19患者中富集的几个微生物属与ARGs相关，包括Megasphaera、Paludibacter、Dialister、Leptotrichia、Bacillus、Parabacteroides和含有Aspergillus、Coprobacter、Klebsiella、Leptotrichia的VFGs。值得注意的是，Leptotrichia、Coprobacter、Veillonella、Klebsiella和Phocaeicola均与ARGs和VFs密切相关。总体而言，这些数据表明微生物生态失调可能与ARGs和VFGs的共存有关。

图5. 健康对照组、无抗生素COVID-19 (ab-)患者和抗生素COVID-19 (ab+)患者中ARGs和VFGs的分布情况。

(A、B)和弦图显示了16种ARG类型(A)和11种VFs (B)与健康对照组、COVID-19 (ab+)和COVID-19 (ab-)的关系。(C、D)小提琴图显示ARGs (C)或VFGs (D)的总相对丰度差异。****p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05，ns：不显著。所有p值均采用Mann-Whitney U检验。

图6. 基于Spearman相关性分析的ARGs、VFGs和细菌属的相关性网络。节点大小直接对应于交互次数。边代表强(Spearman's r > 0.6)且显著(p < 0.05)的相关性。

讨论

目前认为COVID-19的疾病严重程度不仅由病毒感染引起，而且与人体微生物群生态失调密切相关。自COVID-19爆发以来，肠道-肺-口腔轴上的微生物群变化在人类口腔、鼻咽、肺和人体肠道中得到了广泛研究，这对于理解SARS-CoV-2引起的微生物群失调如何影响疾病严重程度并导致宿主代谢障碍至关重要。另一个值得关注的问题是，COVID-19治疗中抗生素的使用是否影响抗生素耐药性和毒力。据报道，由于口腔和下呼吸道的邻近性和连续性，口咽部微生物群可能是肺部微生物组的一个关键指标。在此，本研究全面分析了与SARS-CoV-2感染可能相关的微生物群，以及抗生素使用对COVID-19患者口咽拭子中ARGs和VFGs的影响，以更深入地了解SARS-CoV-2的发病机制和适当的治疗方法。 如前所述，不同的队列研究得到了不同的结论。一个可能的原因是影响微生物群组成的宿主因素没有调整，如年龄、性别和合并症。以往的研究报道，性别和年龄是影响微生物群组成的因素，而肥胖和高血压等并发症与厚壁菌门和拟杆菌门密切相关。在本研究的队列中，入组的个体年龄和性别匹配，几乎没有慢性病状态。尽管这些COVID-19患者接受了抗生素治疗，但在接受和未接受抗生素治疗的患者中发现了相似的微生物群落结构。因此，该队列确保了微生物变化主要是由SARS-CoV-2引起的，而不是宿主因素。 与上呼吸道标本的几项研究一致，我们观察到COVID-19患者与健康对照组相比，微生物多样性降低，微生物组成不同，而中度患者和重度患者之间的差异有限。值得注意的是，我们观察到COVID-19患者在门水平上的拟杆菌门显著减少，这与先前的报道一致，即SARS-CoV-2感染降低了口腔和肠道中的拟杆菌门。有报道称，拟杆菌门的一些成员降低了小鼠肠道中血管紧张素转换酶2 (ACE2)的表达，表明SARS-CoV-2入侵宿主的可能机制是通过改变微生物群来抑制ACE2的减少。

此外，最近的一项研究表明，肠道中较低的厚壁菌门/拟杆菌门比值可能是COVID-19严重程度的生物标志物。在口咽拭子中，我们还观察到重度COVID-19患者的厚壁菌门/拟杆菌门比值(0.92)低于中度患者(1.15)，表明上呼吸道中厚壁菌门/拟杆菌门比值可能是COVID-19患者病情严重程度的有效标志。除了Veillonella、Acinetobacter和Klebsiella等机会致病菌属表现出与其他研究相似的增加趋势外，我们还发现Leptotrichia wadei在健康组、中度COVID-19患者和重度COVID-19患者之间存在显著差异。Leptotrichia wadei作为口腔中的机会致病菌，可上调炎性细胞因子和趋化因子，这可能与SARS-CoV-2的发病机制有关。此外，引起菌血症的细菌Lachnoanaerobaculum在重度患者中的丰度高于中度患者，这可能有助于继发性细菌感染。然而，由于样本收集困难，样本量较小，本研究存在局限性。这是我们无法建立由SARS-CoV-2引起的标记微生物之间的相关性的关键原因。 此外，作者注意到与中度患者相比，重症患者中一些与毒力因子分泌相关的通路被富集，如“分泌系统”、“ABC转运蛋白”和“转运蛋白”通路。值得注意的是，活跃的“ABC转运蛋白”的存在表明，患者在SARS-CoV-2感染后可能更容易受到病毒毒力的影响，因为这些蛋白能够将病毒毒素和其他毒素主动转运出细胞。因此，我们认为细菌合成和分泌毒力因子的活性增加可能与病毒发病机制有关。 

抗生素用于控制住院COVID-19合并细菌/真菌感染患者的病情或减轻炎症。关于是否应该使用抗生素的争论一直存在，因为它可能对促进ARGs产生长期的影响。我们已经了解到，与不使用抗生素治疗的COVID-19患者甚至健康对照组相比，在使用抗生素治疗的COVID-19患者中发现了更多的ARGs。抗生素耐药性和毒力的共存由于其相对独立的进化路线而未被广泛认识。以前基于实验室的研究表明，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性和毒力之间存在合理的生态学和生物学联系。然而，尚无基于整个微生物组和基因组的研究应用于调查COVID-19患者的这一特征。在本研究中，宏转录组数据使我们能够根据COVID-19患者和健康对照组构建微生物组、ARGs和VFGs之间的网络。有趣的是，在COVID-19患者体内富集的致病菌中出现了耐药性和毒力共存的现象，其中Dialister、Leptotrichia、Bacillus与耐药基因有较强的相关性，其他报道也证实了这一点。由选择压力引起的高毒力和广泛耐药菌株不仅有利于适应抗菌药物，还具有入侵和定植宿主的能力，给疾病控制带来困难。然而，抗生素在COVID-19大流行中的使用是否作为一种选择压力而造成伤害还有待观察。 随着COVID-19大流行的持续和新型变异株的不断出现，SARS-CoV-2的致病机制及其有效治疗方法仍不明确。微生物的生态失调如何参与SARS-CoV-2的发病机制有待深入研究。此外，在制定治疗策略时，应合理考虑抗生素引起的相应ARGs和VFGs。

结论

本研究阐明了呼吸道微生物组在COVID-19中的作用，揭示了与健康对照组相比，住院COVID-19患者的微生物紊乱和微生物功能活动减弱的情况，以及COVID-19患者康复后的体内稳态重建。此外，本研究发现抗生素耐药性和毒力的共存与SARS-CoV-2引起的微生物组改变密切相关。这些结果强调了继续研究呼吸道微生物组对SARS-CoV-2感染的影响的重要性，并谨慎考虑抗生素治疗。

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