草酸盐转运蛋白OxlT在肠道微生物群中草酸盐降解细菌中的结构和机制

Jaunet-Lahary T, Shimamura T, Hayashi M, Nomura N, Hirasawa K, Shimizu T, Yamashita M, Tsutsumi N, Suehiro Y, Kojima K, Sudo Y, Tamura T, Iwanari H, Hamakubo T, Iwata S, Okazaki KI, Hirai T, Yamashita A. Structure and mechanism of oxalate transporter OxlT in an oxalate-degrading bacterium in the gut microbiota. Nat Commun. 2023 Apr 3;14(1):1730. doi: 10.1038/s41467-023-36883-5. PMID: 37012268; PMCID: PMC10070484.

肠道微生物群中的草酸盐降解细菌吸收食物来源的草酸盐，将其用作碳和能量来源，从而降低宿主动物肾结石形成的风险。细菌草酸盐转运蛋白OxlT选择性地将草酸盐从肠道吸收到细菌细胞，与其他营养羧酸盐严格区分。在这里，我们呈现草酸盐结合和无配体OxlT的晶体结构，具有两种不同的构象，闭塞和向外状态。配体结合口袋含有碱性残基，这些残基与草酸盐形成盐桥，同时防止构象切换到没有酸性底物的闭塞状态。闭塞的口袋可以容纳草酸盐，但不能容纳较大的二羧酸盐，例如代谢中间体。来自口袋的渗透途径被广泛的域间相互作用完全阻断，这些相互作用可以仅通过与基板相邻的单侧链的翻转来打开。这项研究显示了代谢相互作用的结构基础，使有利的共生成为可能。

草酸盐是最小的二羧酸盐（C2O42–）通过我们的日常饮食从含草酸盐的食物中摄取1，如蔬菜、豆类和坚果2.草酸盐也是我们体内的最终代谢产物，部分通过体循环分泌到肠道1.然后从肠道吸收并通过肾脏排泄3.然而，过量的草酸盐与血钙形成不溶性盐并引起肾结石疾病（图）。1一).产草酸草酸杆菌是肠道中的草酸盐降解细菌4可以代谢分解肠道草酸盐，从而显着促进宿主动物（包括人类）的草酸盐稳态3,5,6.事实上，囊性纤维化患者7或炎症性肠病8或接受过空肠搭桥手术的人9已知甲醛奥菌定植率低，高草酸尿症和肾结石形成的风险增加。

图1OxlT的结构。

肠道中草酸盐降解细菌O. formigenes中OxlT功能的示意图。b， c 草酸盐结合的晶体结构（PDB ID 8HPK;b）和无配体（PDB ID 8HPJ;c） OxlT.d 草酸盐结合和无配体的OxlT的叠加。显示了周质的视图（顶部）和跨膜平面中的两个视图（底部）。e， f 草酸盐结合 （e） 和无配体 （f） OxlT 的表面静电势图。±5 kTe 时的静电势−1被映射在表面上。

草酸盐转运蛋白（OxlT），一种草酸盐：甲酸盐反转运体（OFA）10在O. formigenes中，是该细菌中草酸盐代谢的关键分子。OxlT 根据羧酸盐的电化学梯度催化羧酸盐在细胞膜上的反端口，其底物特异性针对 C2 二羧酸盐草酸盐进行了优化。事实上，转运蛋白显示出草酸盐自我交换的高周转率（>1000 / s）11,12.在草酸自养O. formigenes的生理条件下，OxlT的羧酸盐交换功能能够从宿主肠道吸收草酸盐作为细菌的唯一碳源并释放甲酸盐（HCO2–），草酸盐的最终降解产物，如果积聚在细菌细胞中是有毒的11–13（图）1一).草酸盐：甲酸盐交换的OxIT催化周转伴随着草酸盐通过脱羧酶向甲酸盐的代谢降解，该酶消耗细胞质中的质子，从而在细菌细胞膜上产生质子电化学梯度11.因此，OxlT充当“虚拟质子泵”，为细菌ATP合成创造质子动力11.因此，OxlT作为草酸盐和甲酸盐之间的反转运体的功能特性，而不是每种化学物质的单转运体，对于耦合碳代谢和能量形成至关重要。值得注意的是，OxlT不接受草酰乙酸（C4H2O52-）或琥珀酸盐（C4H4O42-），它们是克雷布斯循环二羧酸中间体，作为底物13.这些具有四个碳原子的二羧酸盐（C4二羧酸盐）是细菌胞质侧的重要代谢中间体，同时它们也通过宿主腔侧的肠道转运蛋白作为能量来源和生物合成前体被吸收14.因此，OxlT区分C2和C4二羧酸盐的能力对于宿主动物和肠道细菌之间的有利共生至关重要。

OxlT属于主要的促进者超家族（MFS），这是一个大型运输商家族，其成员运输各种化学品10.MFS蛋白具有十二个跨膜（TM）螺旋的共同结构，这些螺旋包含六个基因复制的TM单元的对称N端和C端，分子中心有一个底物结合位点15,16.MFS系列以及其他转运体系列的基板传输机制由“交替访问模型”解释17，其中转运蛋白分子交替打开从结合位点到膜任一侧的空腔，并通过N端和C端结构域的“摇臂开关”运动采取面向外部，闭塞和向内的构象，从而允许底物跨膜转移18–20.尽管已经积累了每个MFS成员的丰富结构信息，但目前关于OFA家族的知识仍然局限于最初通过电子晶体学在6.5 Å下求解的OxlT结构。21,22.因此，OxlT的具体草酸盐识别和反端口机制尚未在更高分辨率的结构中阐明。

在这项研究中，我们报告了OxlT在3.0-3.3 Å下以草酸盐结合和无配体形式解析的X射线晶体结构，以了解这些关键转运蛋白功能的结构基础，这些功能是这种草酸盐降解细菌在肠道中共生的基础。

结果

两种不同构象的 OxlT 结构

野生型OxlT在各种条件下都不稳定，例如在氯离子存在下12,23，这大大缩小了结晶筛选的可用化学空间。对于OxlT的结构研究，采用了抗体辅助结晶策略。通常，与膜蛋白中的构象表位特异性结合的Fab或Fv抗体片段可以增加可用于形成刚性晶格的亲水表面积。此外，结合的抗体片段会降低固有的蛋白质灵活性和构象异质性，增加膜蛋白成功结晶的可能性24,25.OxlT通过结合两个不同的抗体片段来稳定，从而在两种不同的条件下结晶。我们确认用于结晶的抗体片段在存在和不存在草酸盐的情况下都与OxlT结合（补充图）。1).因此，抗体片段不太可能人为地将OxlT捕获在特定构象中。草酸盐结合的OxlT与Fab片段配合物的晶体结构在3.0 Å（PDB ID 8HPK）下解析，而无配体的OxlT在Fv片段配合物中的晶体结构在3.3 Å（PDB ID 8HPJ）下解析（补充图）。2一,b和补充表1和2).

OxlT的整体结构由12个TM螺旋组成（图）。1b， c），如在之前的 EM 结构中观察到的21后来被确认为典型的MFS架构15,16.在草酸盐结合状态下，OxlT蛋白采用闭塞构象，草酸盐分子在结构中心结合（图）。1b， e).相反，无配体的OxlT具有与草酸盐结合形式截然不同的构象（图）。1c， d， f).OxlT蛋白在N-（TM1-6）和C端（TM7-12）结构域之间显示出一个大的V形空腔，该空腔从中心草酸盐结合位点连接到周质，这是向外构象的明显特征。

在闭塞结构和朝外结构的比较中，所有残基的Cα均方根偏差（RMSD）为2.6–2.7 Å（图）。1d).即使是两者中唯一的N端或C端结构域也显示出相当大的结构差异（Cα RMSD为~1.5-1.6Å）。因此，具有“摇臂开关”运动的闭塞状态和向外状态之间的结构变化不是通过刚性结构单元的倾斜来实现的，而是伴随着它们的弯曲。事实上，在向外结构的TM1，2，4，7，8和11上观察到周质部分的明显弯曲，其他周围的TM螺旋倾斜（图）。1d).相反，两种构象之间的细胞质部分没有显着差异。在其他MFS蛋白中，例如GLUT5和NarK，在不同的构象状态之间观察到TM螺旋中的甘氨酸残基弯曲26,27.OxlT有52个甘氨酸残基，约占氨基酸含量的八分之一（12.4%）（图）。1d，补充图。2c,d和3).值得注意的是，这种甘氨酸频率高于其他MFS蛋白，如LacY（8.6%），GLUT5（7.6%）或NarK（10.4%），以及其他膜蛋白中的TM螺旋（~8.7%）28.因此，在实现OxlT中状态之间的构象切换方面，甘氨酸残基处TM螺旋弯曲的积累似乎更为突出。在N端和C端结构域之间的界面处也发现了甘氨酸残基，如TM5和TM8或TM2和TM11（补充图）。2c,d），并实现了先前报道的紧密螺旋填料28,29.在OxlT中观察到的高甘氨酸存在可能需要在分子中心闭塞草酸盐，草酸盐对于运输底物来说很小。相反，富含甘氨酸的结构可能是洗涤剂胶束中OxlT不稳定的原因，这在没有抗体片段和功能测定的情况下阻碍了结晶，如下所述。在其他OFA蛋白中也观察到高甘氨酸比（10.2±1.1%，具有15个严格保守的位置;在补充图所示的11个家族成员中观察到。3），并且可能是家族特征。

草酸盐结合闭塞结构

在晶体结构（PDB ID 8HPK）中，与OxlT结合的草酸盐分子被细化为扭曲构型（图）。2一和补充图。4一).已知草酸盐二阴离子中两个羧基之间的键是单一且未共轭的，允许羧基围绕C-C键自由旋转30.由于草酸盐结合的OxlT结构的分辨率不足以精确确定草酸盐的二面角，我们对闭塞的OxlT结构中的草酸盐结合进行了量子力学（QM）和量子力学/分子力学（QM / MM）计算，以检查能量最小化的构象。草酸盐中产生的O-C-C-O二面角在50-68°以内（补充图）。4b,c和补充表3).这些值接近在原始晶体结构（60.1°）中观察到的值，验证了草酸盐不是平面的，而是在晶体结构中扭曲的。

图2草酸盐结合的闭塞OxlT结构。

a 草酸盐结合的OxlT结合位点的特写（PDB ID：8HPK）。虚线表示潜在的氢键和盐桥。还显示了带有原子标记的结合草酸盐分子的放大视图。b OxlT（带下划线标签）和NarK（绿色，带正常标签;PDB ID：4U4W）基于氨基酸残基与底物相互作用的拓扑相似性。c 通过GFP-TS进行草酸盐结合测定。数据表示在三个独立实验中±添加3mM草酸钾引起的熔融温度升高的SEM平均值。WT：野生型。d 使用重组大肠杆菌细胞进行草酸盐摄取测定。突变体OxlT与同一天测量的WT OxlT的相对转运活性设置为100%，而不表达OxlT的细胞的相对转运活性36设置为 0%，显示。条形表示每个突变体的单个实验中技术重复测量的平均值。R272A和K355Q突变体的结果是从以前的研究中转发的36为了比较。e 草酸蛋白脂质体摄取测定。测量脂质体裂解物中所得草酸盐浓度，并在60分钟时归一化为WT OxlT的浓度。没有OxlT的脂质体的结果显示为“空”。条形表示三个（空、WT 和 R0A 在 60 分钟和 272 分钟的数据）或两个（其他）独立实验中结果的平均值。AU：任意单位。在图c和e中，使用WT OxlT作为对照的Dunnett检验通过双侧单向方差分析分析数据，并在补充表中提供了确切的P值6.*P < 0.05， **P < 0.01， ****P < 0.001。红色条表示在先前研究中表现出活性丧失的突变体（或相同残基的突变）31,32,34.f 域间相互作用将腔封闭到细胞质。g OxlT细胞质侧的离子相互作用网络。h 域间相互作用将腔封闭到周质。

在OxlT的结合位点，草酸盐与转运蛋白结合，一个羧基与TM272中的Arg8形成双齿盐桥，而另一个羧基与TM355中的Lys11形成离子相互作用（图）。2一).除了与草酸盐的盐桥接外，Lys355中的ε-氨基与N端结构域中Gln34（TM1）和Gln63（TM2）中的羧酰胺基团形成域间氢键网络。类似地，Arg272中的胍基与Ala147（TM5）中的主链羰基形成域间氢键，并进一步与TM268上游Asn8的侧链羧酰胺和主链羰基相互作用。Arg272 周围的区域是 TM8 中的弯曲点，由于 N 的序列268广义词典272P，因此Arg272和Asn268之间的氢键可能维持TM8在草酸盐结合结构中的构象和取向。这些涉及Arg272和Lys355的域间和域内氢键网络可能在组织结合口袋的结构和稳定闭塞构象方面发挥关键作用，尽管这两个碱性残基位于C端结构域内。这两种碱性残基在OFA家族中是保守的（补充图）。3），对于草酸盐转运至关重要，甚至R272K或K355R突变也会降低转运活性31–33.这些结果证实了观察结果，即不仅电荷而且两种残基侧链的化学结构对于结合位点的结构组织都很重要。

除了两种碱性残基外，还发现许多芳香族残基有助于草酸盐结合。Tyr35和Tyr124的羟基与草酸盐中的任一羧基形成氢键（图）。2一).此外，Tyr150、Trp324、Tyr328和Trp352中的芳族侧链基团与草酸盐中的羧基形成面对面或边对面π π相互作用，表明草酸盐中的π电子系统对OxlT分子识别具有重要意义。这些芳烃残基分布在N端和C端的两半，因此它们与草酸盐的相互作用也稳定了域间空腔的闭合以实现闭塞构象。此外，Trp352（TM11）与Gln66（TM2）形成域间氢键。这些芳烃残基在属于OFA家族的蛋白质中是保守的（补充图。3).事实上，在以前的研究中，Tyr150或Trp352的突变与运输功能的丧失有关。31,34.值得注意的是，在硝酸盐/亚硝酸盐波特（NNP）家族中，NarK识别硝酸盐（也具有π电子系统）时观察到离子和π-π相互作用的类似组合。26,29，尽管NNP家族与OFA家族相距甚远10并且所涉及的残基的位置彼此不对应（图。2b).

考察了上述或其邻近残基对草酸盐结合和转运的意义。由于纯化的OxlT不稳定，特别是在没有底物的情况下，我们使用了多种功能测定：（1）GFP热位移（GFP-TS）测定35评估草酸盐结合的能力，利用含有来自宿主大肠杆菌细胞的脂质的粗糙、洗涤剂溶解的 OxlT-GFP 融合蛋白;（2）使用重组表达OxlT的大肠杆菌细胞进行纤维素转运测定36;（3）使用用纯化的OxlT重组的蛋白脂质体进行体外运输测定。在GFP-TS测定中，野生型OxlT在草酸盐结合时表现出热稳定性。相比之下，突变型OxlT蛋白Q34A，Y35A，Y124A，Y150A，N268A，R272A，W324A和K355Q的草酸盐依赖性热稳定程度降低（图）。2c).由于在没有草酸盐的情况下，突变型OxlT蛋白的热稳定性与野生型OxlT的热稳定性没有显着差异（补充图）。5），这些结果表明，残基处的突变导致草酸盐的结合亲和力降低和/或结合结构的稳定性降低。在纤维素转运测定中，通过共表达的异视紫质的耦合光驱动质子向内转移以及由此产生的外部溶液的pH升高来评估大肠杆菌细胞中OxlT的草酸盐-甲酸盐交换程度，这是负电性的36（图）2d).除了非功能性突变体R272A和K355Q31,32，在我们之前的研究中已经验证了它们的活动损失36，与Q34A，Y35A，N268A，W324A，Y328A和W352A的OxlT突变也降低了活性（图）。2d).最后，使用重组成蛋白脂质体的纯化OxlT对R272A和先前研究中未用该方法测试的突变体进行了体外转运测定（图）。2e和补充图。6).在蛋白脂质体和纤维素测定之间观察到类似的趋势，尽管由于两个系统的差异而存在一些小的偏差。有趣的是，虽然大多数突变体表现出结合和转运活性的降低，但Y124A和W324A突变对转运活性没有显着影响，至少在任何一个转运测定中，尽管草酸盐结合能力降低。这些观察结果可能是由于速率亲和力权衡和/或底物外排减少而导致净摄取加速37.相比之下，与野生型OxlT相比，Y328A和W352A表现出相似的草酸盐结合，但草酸盐摄取活性降低，表明这些残基对催化周转的重要性。因此，功能研究结果表明，OxlT结构中结合草酸盐附近的残基在草酸盐结合和/或转运中起重要作用。

基底与闭塞的OxlT晶体结构中的残基之间的相互作用被优化为C2二羧酸草酸盐。由于草酸盐分子紧密贴合结合口袋，因此用较大的二羧酸盐（例如克雷布斯循环中间体）代替草酸盐会导致与OxlT中的残基发生空间位阻冲突，从而可能破坏闭塞构象的稳定性（补充图）。7一).一项灵活的对接研究导致可以在闭塞的OxlT的结合位点容纳C3二羧酸丙二酸盐丙二酸盐的位置，尽管与草酸盐的情况相比，由于结合口袋中氨基酸残基的重排，其相互作用较少（补充图）。7b).这与丙二酸的亲和力和转运活性降低一致，K d值为 1.2 mM，而草酸盐的值为 0.02 mM13.即使使用灵活的对接，也没有观察到C4二羧酸盐与闭塞的OxlT结合的姿势，这与先前的报告一致，表明这些分子不会与草酸盐显着竞争OxlT的吸收13.GFP-TS测定证实了草酸盐对OxlT的最高特异性;在草酸盐（C2）存在下，OxlT的热稳定性明显，但在丙二酸盐（C3）或琥珀酸盐（C4）存在下则不然（补充图）。7c).

从草酸盐结合位点到细胞质或周质，观察到N端和C端结构域的TM螺旋之间广泛的分子内相互作用，例如TM2和TM11，TM5和TM8，TM1和TM7的周质半部以及TM4和TM10的细胞质半部（图）。2f–h).这些相互作用稳定了闭塞结构中域间空腔的闭合。

在草酸盐结合位点下方的细胞质侧，观察到涉及Met128（TM4）、Pro332（TM10）和Tyr348（TM11）的疏水相互作用，其次是Asn129（TM4）和Ser344（TM11）、Arg133（TM4）与Thr341和Ala342（TM11）的主链羰基之间的极性相互作用（图）。2楼).这些相互作用进一步得到细胞质末端的电荷偶极相互作用的支持，分别在Asp78（TM2）或Asp280（TM8）和TM11或TM5的N端之间形成（图）。2克).两个天冬氨酸残基位于TM2-3（'G74YFVD78KFGP82R83IP' 序列，AL2-3） 或 TM8-9 （G276FVSD280基格尔284YK， 序列， AL8-9） 区域（补充图。3).基序A是MFS蛋白中通常保守的基序之一，已知D（+5）参与域间电荷-螺旋偶极相互作用38.值得注意的是，这些天冬氨酸残基在细胞质侧进一步构成了广泛的离子相互作用网络（图）。2克).具体来说，TM78中的Asp133和Arg4以及TM137中的下游残基Asp16和Arg1形成盐桥。再往下游，TM139 N 端的 Arg5 与 Asp337、Arg284 和 Asp280 形成电荷中继网络。

在草酸盐结合位点上方的周质侧，TM38中的Thr1（侧链）和TM240（7.2 Å）中的Val72（主链）之间的氢键关闭了闭塞构象中的孔隧道（图）。2小时).在氢键上方，Leu39（TM1），Leu52（TM2），Val244和Pro245（TM7）和Val261（TM8）形成疏水相互作用。

无配体的外向结构

与草酸盐结合的OxlT中阻塞的底物结合位点相反，从结合位点到周质空间的大空腔在无配体OxlT中是开放的（PDB ID 8HPJ;无花果。1楼).在空结合位点，由于电荷排斥，Lys355侧链从Arg272翻出，并从草酸盐结合形式中发现的位置转移位置（图）。3一).在无配体形式中，在草酸盐结合状态下观察到的大部分域间氢键被保留。然而，从侧链之间的距离（>~355 Å）来看，C端结构域中的Lys34和N端结构域中的Gln4之间的Lys35在无配体状态下可能会被破坏。还观察到周围芳烃残基的位置偏移，例如Tyr150，Tyr324，Trp328和Tyr<>（图）。3b).由于缺乏草酸盐，底物结合位点的这些变化可能是整体结构结构重排的基础，并导致闭塞状态和向外状态之间的构象变化。值得注意的是，周质的空腔开口显示出广泛的带正电的表面（图。1楼和和 3c）。3c).该基本性质主要来源于结合位点中的Arg272和Lys355。此外，Lys45和Arg248中的侧链氨基以及Gln34，Asn42，Gln56，Asn264，Asn265和Asn268中的酰胺基团现在暴露于溶剂中。这些基团和TM1、TM5和TM11的弯曲螺旋的正偶极矩也有助于整个空腔的基本性质（图）。3c).Arg272和Lys355在空配体结合位点以及空腔的广泛基本表面上引起的电荷排斥力可能阻止在没有草酸盐的情况下将口袋封闭成闭塞形式，从而稳定开放状态。在没有底物的情况下，开放状态构象的稳定性，防止过渡到闭塞状态，这是OxlT作为反转运体功能的基础，其中在催化过程中没有底物的构象开关是不允许的22,38.在硝酸盐/亚硝酸盐反转运体 NarK 上观察到类似的情况29，其中开腔的带正电荷的表面稳定了向内构象26.

图3无配体的外向OxlT结构。

a 从图中的相同方向观察的无配体OxlT（PDB ID：8HPJ）中的结合位点特写。2一.域颜色编码如图所示。1c.虚线表示潜在的氢键。b OxlT的底物结合位点结构以草酸盐结合和无配体形式叠加。c 向周质开放的空腔的特写。暴露于空腔和表面的极性残留物模型，用±5 kTe处的静电势图着色−1也显示出来。在图a-c中，定义为链A的分子显示为代表。

另一方面，无配体OxlT结构的细胞质部分与草酸盐结合结构的细胞质部分没有显着变化（图）。1d).

OxlT的底物结合和构象动力学

为了解决OxlT的结构动力学问题，实现了运输循环所需的构象转换，我们进行了分子动力学（MD）模拟。39基于草酸盐结合的闭塞和无配体的向外OxlT晶体结构。

我们首先通过将草酸盐定位在蛋白质外部来模拟草酸盐与无配体向外构象（PDB ID 8HPJ）的结合（图）。4a–c和补充图。8).在Gln34，Tyr35，Arg272，Tyr328和Lys355中，观察到草酸盐离子与OxlT结合位点的结合（图）。4b).草酸离子的几何中心与结合位点残基之间的距离（截止距离为5 Å）决定了结合（图）。4c).草酸根离子与Lys355的相互作用解决了其与Arg272的无配体形式的电荷排斥，并使侧链的构型从翻转状态恢复。带负电荷的草酸离子的快速结合通过广泛的带正电荷的表面促进（图。1楼和和 3c）。3c).结合构象的稳定性取决于Lys355的质子化状态（参见pK的方法一个计算），这可能受到肠道管腔pH值的影响，不同地区从5到8不等40，以及结合位点的疏水环境41.对于质子化的Lys355，观察到单个结合事件，并且在模拟的其余部分，结合的草酸离子大部分保留在结合位点（图顶部面板中的灰线）。4c).相反，对于中性Lys355，观察到不同草酸离子的多个结合和解结合事件（图底部图中的彩色线条）。4c).这导致质子化Lys98的6.355%的占用率高于中性Lys77的0.355%，这是通过使用草酸盐和结合位点距离的结合态的上述定义计算得出的。因此，预测质子化的Lys355的草酸盐解离常数较低。在1.7 μs模拟过程中，OxlT的向外构象是稳定的，如来自外向晶体结构的主链原子的RMSD图所示（图）。4一).结果表明，模拟中观察到的草酸盐结合是一种早期结合模式，随后应进行结合位点的构象重排和去溶剂化，并过渡到闭塞构象以适应完全结合的构象。

图。4OxlT的底物结合和构象动力学。

a–c MD模拟从无配体的外向OxlT晶体结构（PDB ID 8HPJ）开始。a 显示了不同颜色的Lys355具有不同质子化状态的两个轨迹的初始向外晶体结构的RMSD。b 与质子化Lys355结合的草酸盐与OxlT的快照。在缩小快照中，距离草酸根离子 15 Å 距离内的水分子以 CPK 颜色显示，而距离 15 到 25 Å 的水分子以蓝色显示。在特写快照中，显示了距草酸盐离子15 Å距离内的水分子。c 图中显示了草酸离子在单个轨迹上与结合位点的距离，质子化的Lys355（顶部）或去质子化的Lys355（底部）。使用草酸根离子的几何中心和结合位点残基来计算距离。不同的颜色代表模拟中包含的不同草酸盐离子。d-f MD模拟从草酸盐结合的闭塞OxlT晶体结构（PDB ID 8HPK）开始。d 初始闭塞晶体结构的RMSDs显示了三个不同颜色的独立轨迹。e OxlT的疏水门。在上图中，距离结合草酸离子 15、8 和 4 Å 距离内的水分子数分别以棕色、黄色和红色绘制。在底部面板中，缩小和特写视图中显示 1000 ns 的快照。水分子的颜色与图b相同。参见 补充电影1.f 观察到的从闭塞到由 Gln34 翻转触发的朝外构象的转变。草酸盐离子和结合位点残基显示在棒状表示中。Gln34 以红色圆圈突出显示。水分子显示在 vdW 表示中。水分子的颜色与图b相同。Thr38侧链和Val240主链之间的黑色和红色虚线分别描绘了H键内或H键外的距离。参见 补充电影2.

接下来，我们讨论了草酸盐结合状态下闭塞构象（PDB ID 8HPK）的构象动力学。在1 μs仿真期间，三个独立轨迹中的两个仍处于闭塞状态（图）。4d).在闭塞构象中，大多数水分子在模拟过程中被阻断在转运蛋白的周质和细胞质侧的某些位置，尽管有些进入OxlT（图）。4e和补充电影1).在模拟过程中，水密度分析精确定位了阻止水进入草酸盐结合位点的结构层（补充图）。9).其中之一是疏水层，由周质侧的TM38中的Thr39和Leu1，TM244中的Val7和TM261中的Val8组成（图左下图）。4e).该层与TM38中Thr240和Val7之间的氢键相结合（如图左下角的虚线所示）。4e），也阻断了配体向细胞外侧的出口，从而起到了周质门的作用。另一层由TM128中的Met4，TM332中的Pro10和TM348中的Tyr11组成（图的右下图）。4e).这些周质和细胞质疏水门与TM1-TM7氢键一起，与先前报道的NarK转运蛋白相似42，基于位于对齐结构中与 OxlT 中相似位置的残基（补充图。10).这一结果表明， 疏水门39是两个转运体之间的保守机制。

相反，在从闭塞构象的一个轨迹中，观察到周质门的打开（图中的蓝线）。4d).在过渡中，首先发生Gln34侧链从结合位点的翻转（图）。4楼，补充图11一和补充电影2).Gln34翻转导致与Lys355的氢键断裂，如在向外晶体结构中观察到的那样（图）。3一).此外，由于Gln34位于TM38中Thr1上游的一圈，翻转也导致Thr38和Val240之间的氢键不断破坏，甚至在翻转之前，氢键就被热波动打开和关闭（如图中的虚线所示）。4楼和补充图。11b).在Gln280翻转~34 ns后，OxlT开始向外开放，许多水分子进入转运体（图）。4楼和补充电影2).我们注意到Gln34翻转是一种瞬态构象，侧链在模拟的最后部分达到向外状态后返回到原始位置，与对向外晶体结构的观察一致（补充图）。11a， c).值得注意的是，在从闭塞构象开始的轨迹中也观察到Gln34翻转，在结合位点中模拟甲酸盐（补充图）。12).在该轨迹中，Thr38和Val240之间的氢键在Gln34翻转后再次完全断裂，随后根据甲酸盐释放到O. formigenes中周质的生理反应，从闭塞到向外的构象过渡。相比之下，在任何其他轨迹中都没有观察到Gln34翻转，没有伴随着草酸盐和甲酸盐结合形式的构象转变（补充图。11和12).这些发现表明，Gln34侧链与Thr38和Val240之间的氢键一起，起到“周质门的闩锁”的作用，以防止从闭塞到向外构象的转变。事实上，Q34A突变体相对于野生型蛋白显示出部分结合和转运活性的丧失（图）。2c–e），表明突变破坏了闭塞构象的稳定性。Gln34和Thr38在OFA家族中是严格保守的（补充图）。3).

Gln90翻转后，闭塞结合位点中草酸盐离子的O-C-C-O二面角变为~34°（补充图）。13一），这是在溶液中观察到的值43.这与没有 Gln34 翻转的其他两条轨迹形成鲜明对比，其中草酸盐二面角保持在 40-50° 左右（其倒置位置为 130-140°;补充图13一），这与晶体结构和 QM/MM 计算中的相似。有趣的是，在模拟过程中观察到的结合草酸盐与向外OxlT的值分布广泛，在~60°和~120°处具有双峰（补充图）。13b），与溶液中的溶液不同，更接近闭塞晶体结构中的溶液。这些发现表明，结合的草酸盐响应OxlT构象转换引起的环境变化而重新排列其构象，并为转运体循环的后续步骤采用有利的构象。

在1 μs模拟期间，没有观察到细胞质门的打开，用于闭塞构象的任何轨迹。这可能是由于在细胞质侧观察到的广泛域间相互作用，例如涉及电荷中继网络的基序A（图）。2克） 已知可稳定向外的构象38.这些结果表明，从闭塞状态到向内开放状态的过渡在整个运输过程中具有缓慢的动力学。一种神秘的突变体显示出草酸盐结合减少但保留了转运活性，Y124A（图）。2c–e），位于结合的草酸盐下方的细胞质门入口处（图。2楼和和4f）。4楼).该突变可能会破坏栅极处疏水层的稳定性并促进其打开，这可能是运输的限速步骤，因此可以补偿其转运活动中对草酸盐的亲和力降低。

讨论

OxlT的两种晶体结构及其模拟为理解OxlT交替访问传输过程提供了线索（图）。5).以下过程根据肠道内O. formigenes中形成的电化学梯度进行描述。对于草酸盐摄取过程，OxlT在向周质开放的空腔中表现出广泛的带正电荷的表面，允许酸性草酸盐与结合位点结合。带正电荷的表面还避免了在没有基板的情况下到下一个传输步骤的构象转变，这是反转运体不可或缺的特征。然而，草酸盐结合中和了局部正电荷，并使构象从向外的构象切换到闭塞构象。此外，计算出草酸盐与OxlT的相对结合自由能显示，与向外开放构象相比，封堵构象显着稳定（即~20 kcal/mol降低），这为草酸盐结合诱导的构象转换提供了物理基础（参见“方法”部分和补充表4).闭塞状态是运输的重要步骤，作为草酸盐和必要的宿主代谢中间体（例如克雷布斯循环中的那些）之间的区分检查点，使用结合口袋施加的大小限制。闭塞的构象最终可能允许细胞质门打开并将草酸盐释放到细胞质中。

图5OxlT的传输过程和构象切换示意图。

OxlT沿周质和细胞质门距离的构象景观显示在右上图中。在闭塞和向外开放状态以及Gln34诱导的转变的MD模拟中，栅极残基的Cα距离分别以红色、黄色和蓝色显示。还显示了当前闭塞（PDB ID 8HPK）和向外（PDB ID 8HPJ）晶体结构以及Narc向内晶体结构（PDB ID 4U4T）中的栅极残余距离。

随后，与向内OxlT结合的甲酸盐可以使转运蛋白返回到闭塞状态。在反端口循环中从闭塞状态返回到初始向外状态所需的构象转变可以通过基底邻近残基 Gln34 的侧链的瞬时翻转以及破坏 Thr38 和 Val240 之间的氢键来实现。由周质门（Thr38-Val240）和细胞质门（Met128-Pro332）距离绘制的构象景观42,44MD模拟中的采样表明，阶次参数很好地分离了闭塞和向外的构象（红色和黄色图，图）。5插图）。然而，伴随Gln34翻转的唯一轨迹显示出覆盖端点遮挡和向外晶体结构的完整过渡（图中的蓝点）。5插图）。单个侧链翻转可以触发的构象变化机制，以及高甘氨酸比促进的结构灵活性，可能是OxlT表现出的快速催化周转的原因12.

这些结构观察表明，OxlT利用MFS结构，并根据宿主动物和肠道微生物之间的有利共生关系进化。OxlT的结构和功能特征也可能是其他OFA家族成员的结构和功能特征的基础。大约有2，000名OFA成员在数据库中注册45，除了 OxlT 之外，其他所有产品在功能上都是无特征的。因此，这项研究也有助于了解未知的“暗”蛋白质家族。澄清OxlT的向内构象（图中的虚线圆圈）。5插图）是理解OxlT结构生物学的下一个挑战。

方法

道德声明

所有动物实验均符合《日本实验动物护理和使用指南》的指导方针，并得到东京大学动物实验委员会的批准（许可号：RAC07101).

OxlT的制备

来自O. formigene菌株OxB 的C末端壬-His标记的OxlT。46在大肠杆菌XL3中在20°C下用24mM异丙基-β-d-吡喃硫代半乳糖苷（IPTG）表达1小时47.将细菌细胞悬浮在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、200 mM 乙酸钾、1 mM EDTA、1 mM PMSF、5 mM MgCl2，20 μg/mL 脱氧腺素酶 I 和 0.23 mg/mL 溶菌酶，pH 8.0），然后使用 EmulsiFlex C-5（Avestin）进行破碎。通过离心（9，600×g30分钟）除去细胞碎片，然后通过离心（185，000×g1小时）收集细胞膜。将膜级分用40 mM 正十二烷基-β-d-麦芽糖苷（DDM）溶解在缓冲液A（20 mM HEPES-KOH，200 mM乙酸钾，10 mM草酸钾和20%甘油，pH 8.0）中，并应用于XK16色谱柱（GE医疗）中的Ni-NTA超流树脂（QIAGEN）或HisTrap FF原油（GE医疗）。用含有1 mM DDM和30–50 mM咪唑的缓冲液A洗涤色谱柱，然后用含有1 mM DDM和250 mM咪唑的缓冲液A洗脱蛋白质。

抗体片段的制备

通过将高密度纯化的功能性OxlT重构为由蛋磷脂酰胆碱（PC）（Avanti极性脂质）和佐剂脂质A（Sigma）的10：1混合物组成的磷脂囊泡来制备蛋白脂质体抗原，以促进免疫反应。BALB / c小鼠（7周龄雌性）每隔两周注射三次，用蛋白脂质体抗原免疫。将小鼠保持在12小时光照/黑暗循环的条件下，环境温度为23±3°C，湿度为40-60%。

D5901晶圆厂

如前所述，选择抗OxlT的小鼠单克隆抗体48.产生抗体的杂交瘤细胞系是使用常规融合方案生成的。通过脂质体酶联免疫吸附测定法（ELISA）在含有纯化OxlT的固定化磷脂囊泡上选择产生识别OxlT构象表位的抗体的杂交瘤克隆，允许对识别OxlT天然构象的抗体进行阳性选择。对抗体与SDS变性OxlT结合减少的额外筛选用于对线性表位识别抗体的阴性选择。使用荧光检测体积排阻色谱法检查OxlT与每个抗体克隆之间的稳定复合物形成。用木瓜蛋白酶解从单克隆杂交瘤大规模培养上清液中收集并用蛋白G亲和色谱纯化的全IgG分子，并使用HiLoad 16/600 Superdex200凝胶过滤分离Fab片段，然后进行蛋白A亲和色谱。使用从杂交瘤细胞中分离的总RNA通过标准5′-RACE测定Fab的序列。

20D033Fv

从免疫小鼠噬菌体展示的抗体库中筛选出针对OxlT的单链Fv（scFv）片段49.免疫小鼠被安乐死，它们的脾细胞RNA通过逆转录PCR分离并转化为cDNA。五世L和 VH通过18个氨基酸的柔性接头组装库，并克隆到噬菌体展示载体pComb3XSS中。将OxlT与蛋PC和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（帽生物素基）（16：0生物素基Cap-PE;Avanti），并用作scFv噬菌体选择的结合靶标。将靶标固定在链霉亲和素包被的顺磁珠（Dynabeads）或链霉亲和素包被的微孔板（Nunc）上。经过四轮生物淘选后，对单个菌落的周质提取物进行了脂质体ELISAs。使用Biacore T100（GE医疗）收集和评估阳性克隆。

抗体scFv片段不适合用作结晶伴侣，因为它们可以分子间形成结构域交换的二聚体，并且二聚体 - 单体平衡可能会增加结构异质性。因此，我们使用Fv片段进行结晶试验。使用iRAT系统在短杆菌中表达Fv片段50.将培养上清液调节至60%硫酸铵饱和度，沉淀沉淀，溶解在TBS缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM和NaCl）中，并在同一缓冲液中透析过夜。将透析蛋白与与缓冲液B（10mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl和20 mM咪唑）平衡的Ni-NTA树脂混合。结合的蛋白质用缓冲液C（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl和250 mM咪唑）洗脱，与TEV-He混合6并在TBS缓冲液下透析过夜。劈开了他的6标签和 TEV-His6使用与缓冲液B平衡的HisTrap色谱柱去除。将无标签Fv片段浓缩并上样到用TBS缓冲液平衡的HiLoad16/60 Superdex75色谱柱（GE医疗）上样。将峰级分合并、浓缩，在液氮中快速冷冻并储存在−80°C。

结晶

为了结晶与D5901Fab络合的草酸盐结合的OxlT，将纯化的OxlT与纯化的D5901Fab在1°C下以1：3.4摩尔比混合过夜，并使用缓冲液D（16 mM MES-KOH，60 mM乙酸钾，200 mM草酸钾，20%甘油和200.10 mM DDM）施加到HiLoad 20/0 Superdex51 pg色谱柱（GE Healthcare）上， pH 6.2）作为电泳缓冲液。纯化的样品在缓冲液E（20mMMES-KOH，10mM草酸钾和0.51mM DDM，pH 6.2）中透析。通过将纯化的样品（~20 mg/mL）与10.0 M柠檬酸钠，pH 1.5，5.0 M NaCl和05% （v / v） PEG26的储液溶液混合，在400 °C下通过坐滴式蒸汽扩散法获得晶体。在数据收集之前，将晶体在液氮中冷冻。

为了结晶与20D033Fv络合的无配体OxlT，将纯化的OxlT与纯化的20D033Fv在1°C下以2：4摩尔比混合过夜，并使用Superdex200在缓冲液F（10mMMES-KOH，300mM乙酸钾，20mM草酸钾和100.10%DDM，pH 0.02）中增加6/2GL（GE healthcare）纯化。纯化的样品复溶成脂质中间相。蛋白质-LCP混合物含有50%（w/w）蛋白质溶液，45%（w/w）单油酸（西格玛）和5%（w/w）胆固醇（西格玛）。将所得脂质中间相以50 μL滴液滴的形式分配到96孔玻璃板中，并使用NT0-LCP结晶机器人（Formulatrix）用8.8 μL沉淀剂溶液覆盖，然后用薄盖玻片覆盖。结晶装置和96孔玻璃夹芯板（分子尺寸）在20°C下孵育。 在以下沉淀条件下，一周内获得晶体：100 mM 甘氨酸，pH 9.0，26–36% （v/v） PEG400 和 50–150 mM MnCl2.使用网格岩石环（蛋白质波）直接从脂质中间相收获晶体，并在液氮中快速冷却。

数据收集和结构确定

草酸盐结合的OxlT和无配体OxlT的X射线衍射数据分别在1.0 Å处使用MX8HE（Raynoix）和BL41XU分别使用EIGER X 225 M探测器（Dectris，Ltd）在BSS的控制下收集。51和以 100 K 运行的冷冻流.数据被合并、整合并使用 KAMO 系统缩放到 2.6 Å（草酸盐结合的 OxlT）和 3.1 Å（无配体 OxlT）52，它利用了 BLEND53、XDS54和 XSCALE55（补充表1).使用 STARANISO 服务器校正了各向异性数据56.校正删除了高分辨率壳中许多球面完整性非常低的弱反射。为了进行细化，我们使用3.0 Å（草酸盐结合的OxlT）和3.3 Å（无配体的OxlT）的数据，分别包含超过25%（草酸盐结合的OxlT）和22%（无配体的OxlT）的数据，在最高的壳中。用相位器进行分子替换求解晶体结构57.搜索模型是甘油-3-磷酸转运蛋白GlpT（PDB ID：1PW4)58和一个 Fab 片段 （PDB ID： 1XF4)59对于草酸盐结合的 OxlT，以及本研究中确定的草酸盐结合 OxlT 的 N 端和 C 端结构（分别为残基 11-199 和 204-404）和 scFv 片段（PDB ID：5B3N)60用于不含配体的 OxlT。使用COOT手动重建结构模型61并用凤凰精炼62.在无配体的OxlT晶体中，在不对称单元中发现了两个单位的OxlT（链A和D）。两者之间没有观察到明显的结构差异（残基0-365的Cα RMSD为15.410 Å）。数据收集和细化统计见补充表1和2.使用MolProbity分析的Ramanchandran统计数据63草酸盐结合的OxlT为97.8%赞成，允许2.2%和异常值为0.0%，无配体OxlT的97.5%赞成，允许2.5%和异常值为0.0%。

配体结合测定

使用GFP热移位测定（GFP-TS）评估OxlT的配体结合35.C端GFPuv融合OxlT的表达载体是先前构建的23，并使用PrimeSTARMax（Takara Bio）和补充数据中列出的寡核苷酸引物通过PCR将突变引入载体中1.蛋白质在BL21（DE3）中表达，基本上如“OxlT的制备”小节中所述，其中蛋白质生产在OD6000.8–0.9，并在20°C下诱导20小时。

将表达C端GFPuv-fusion OxlT的细菌细胞悬浮在缓冲液G（20mM HEPES-KOH，300 mM乙酸钾，pH 7.0）中，并使用UD201（TOMY）超声处理破坏。为了获得膜级分，通过离心除去细胞碎片（17，800×g在15°C下4分钟），然后将上清液在252°C下以000，30×g离心4分钟。 通过用缓冲液G重复悬浮液洗涤膜级分两次，然后在252°C下以000，30×g超速离心4分钟。 将来自 20 mL 培养物的膜级分溶解在含有 240% （w/v） DDM 的 480 或 1 μL 缓冲液 G 中。在4°C下溶解1小时后，通过在161°C下超速离心000，20×g4分钟除去不溶性物质。

对于突变测定，用含有1%DDM的缓冲液G稀释洗涤剂溶解的野生型和突变的OxlT-GFPuv蛋白，以调节OxlT-GFPuv浓度，从而获得相同的荧光强度。然后将溶液在存在或不存在1mM草酸钾的冰上孵育3小时。对于配体测定，将野生型OxlT-GFPuv溶液在存在或不存在10mM草酸钠，丙二酸钠或琥珀酸钠的情况下孵育。孵育后，将缓冲液G中的辛基-β-d-葡萄糖苷加入至终浓度为1%，并使用C-30触摸热循环仪（BIO-RAD）在80–10°C下对溶液进行热变性1000分钟。然后通过在10°C下以740，15–340，14×g（使用TOMY PCR000-96转子02，20rpm，取决于转子中的管位置）离心溶液4分钟来除去聚集的馏分。 将所得上清液等分到384孔低体积黑色微孔板（康宁）中，并使用Varioskan闪光灯（赛默飞世尔科技）在395nm的激发波长和507nm的发射波长下测量荧光强度。将观察到的荧光强度与缓冲液背景的荧光强度减去，并将未热变性的样品值设置为1，背景设置为0。表观熔化温度（Tm）的值是通过将荧光强度值拟合到吉布斯-亥姆霍兹方程来估计的64使用万花筒图（Hulinks），假设感兴趣的蛋白质处于折叠和展开状态之间的平衡，并设置展开的焓和热容变化（ΔH，ΔCp） 和 Tm作为自变量。数据通过邓内特测试的双侧单向方差分析进行分析，使用百搭型（WT）作为Prism 8（GraphPad）中的参考。统计显著性定义为 *P < 0.05。

运输检测

使用具有重组大肠杆菌细胞的纤维素系统和用纯化的OxlT重组的蛋白泊酶体的体外系统评估OxlT的转运活性。对于突变型 OxlT 测定，将突变引入 OxlT 表达载体 pRSF-OxlT36，通过使用PrimeSTARMax和补充数据中列出的寡核苷酸引物进行PCR处理1.

在纤维素测定中，OxlT活性是通过与大肠杆菌中共表达的异视紫质素与光驱动的向内质子转移偶联来测量的，如前所述36.简而言之，用OxlT和异视紫红质表达载体转化的大肠杆菌BL21（DE3）细胞在37°C下培养，并通过在1nm处以10.0-8.0的吸光度添加9mM IPTG和600μM全反式视网膜（Sigma）诱导蛋白质产生。在20°C下培养20小时后，通过离心收集大肠杆菌细胞并用50mM K悬浮2所以4至660nm处OD为~10的细胞密度。使用连续搅拌在25°C下用pH电极监测细胞悬液的光诱导pH变化。首先将细胞悬液置于黑暗中，直到样品的pH值稳定。然后使用Xe灯通过锐切滤光片Y44（≥420nm处的长波通滤光片，HOYA）照射样品10分钟，并在没有草酸盐（ΔpH）的情况下pH变化0）被监视。光强度调整为 ~150 mW/cm2在 550 nm 处使用光功率计和光学传感器。将照明的样品放回黑暗中，当pH稳定时，向样品中加入5mM草酸钾，以便通过OxlT运输10分钟。在与上述相同的条件下再次照亮样品，并且pH值发生变化（ΔpHS）被监视。通过ΔpH之间的pH变化（ΔΔpH）差异来评估转运活性S和 δpH0;通过减去单独表达异羟视紫红质的大肠杆菌测量的背景差异pH变化（ΔΔpH）来进一步纠正这一点。通过校正的ΔΔpH和相对表达水平对每个突变体的活性进行归一化，使用实验当天测量的野生型OxlT的Penta∙His抗体（QIAGEN，货号34460，1：2000稀释度）进行西印分析（补充图）。14;未裁剪的印迹位于源数据文件中）。我们还对Y150A突变体进行了检测;然而，由于未知原因，该突变体影响了异视紫质的表达水平（补充图）。14），因此我们从本文中排除了Y150A的结果。

在体外测定中，WT和突变的OxlT蛋白如上所述表达和纯化，并在“OxlT的制备”小节中进行微小的修改。在洗脱缓冲液中不含甘油的情况下，从Ni-NTA树脂中洗脱OxlT蛋白，并在与200 mMMES-KOH、10 mM乙酸钾、300.20 mM DDM、pH 200.0平衡的体积排阻色谱柱Superdex 2 6/2 GL（GE医疗）上纯化。将单体级分合并，浓缩至~1 mg/ml，补充20%（v / v）甘油，定量，等分并快速冷冻以备进一步使用。蛋白脂质体的制备方法与Lee等人描述的相似。65.将大肠杆菌总脂质提取物（Avanti，氯仿）等分到玻璃管中，在氮气流下室温下将溶剂蒸发5min以上。为了获得单层囊泡，将干燥的大肠杆菌脂质以6.7mg / ml重悬于含有50mM MOPS-KOH和10mM甲酸钾的溶液中，pH 7.0，并在水浴超声仪中超声处理45秒。使用液氮和水浴的三个冻融循环，用200：1（w / w）脂质：蛋白质比纯化的OxlT变体或等效体积的对照缓冲液（50mM MOPS-KOH，1.57mM DDM，与OxlT溶液相同的体积）在微管中重建单层囊泡。使用冰上的手动探针装置对重组的单层囊泡共超声处理15次，共200 s，以形成直径为<<> nm的（蛋白）脂质体。

通过在50°C下向脂质体溶液中加入20mM草酸钾来开始草酸盐摄取测定。 在开始实验之前，将AG1-X8阴离子交换树脂（BioRad）与1：1（w / v）体积的150mM乙酸钠，pH 8.2平衡，并通过在离心柱上以400×g和1°C离心700μL浆液4分钟来制备。总之，在孵育后立即或在图中所示的时间内孵育后收集50 μL反应。通过将反应溶液施加到AG1-X8离心柱上并在1×g和700°C下离心4分钟，除去脂质体外的草酸盐离子，并将样品收集在微管中。随后，向每个样品中加入 5 μL 的 10% （w/v） Triton-X100（Nacalai tesque）溶液，以溶解含有草酸盐离子的脂质体，这些脂质体被转运到脂质体中或粘附在脂质体中。使用草酸氧化酶（OxOx）检测试剂盒（Abcam）与使用重组OxOx（枯草芽孢杆菌，Biovision）的氧化反应相结合，测定相对草酸盐浓度。将 10 μL 脂质体裂解物与 10 μL 检测缓冲液（9 μL OxOx 测定缓冲液、0.4 μL OxOx 转换器、0.2 μL 红色探针、0.02 μg OxOx、最多 10 μL 含水）混合在小容量 384 孔板（康宁）的每个孔中，用多通道移液器。Varioskan Flash立即以荧光动力学模式读取该板，激发波长为535 nm（12 nm带宽），发射波长为587 nm，积分时间为200 ms，室温下间隔为20 s，共83分钟。荧光-时间曲线的初始斜率通过前600-s数据的线性回归确定，并解释为OxOx反应的初始速度，该速度与该测定条件下的草酸盐浓度呈线性相关（补充图）。6).对OxlT变体和阴性对照进行至少两种独立的脂质体制剂和草酸盐转运测定，并且每种情况一式两份或一式四份进行OxOx测定。最终条形图显示 60 分钟时 WT 数据平均值的归一化值。

数据（在体外测定的情况下60分钟的数据）通过双侧单向方差分析进行分析，使用WT作为参考的Prism 8中的Dunnett测试。统计显著性定义为 *P < 0.05。

分子动力学模拟

使用OxlT晶体结构作为初始结构，使用MODELLER建模的中心环处缺失残基66.使用PROPKA 3.1分析质子化状态67,68，使用默认参数。根据分析，Lys355表现出偏差的pK一个在面向外部的结构中值为 7.00。在闭塞结构中未观察到这种偏差（pK一个值为 8.61）。因此，Lys355的两个质子化态都被认为是向外状态。OxlT蛋白使用CHARMM-GUI中的膜生成器插件嵌入膜中69,70.x和y尺寸使用长度为1 Å的2-棕榈酰基-120-油酰磷脂酰乙醇胺（POPE）双层。PE脂质是两种O. formicien的主要成分71，OxlT来源于大肠杆菌和大肠杆菌72，其中进行了运输测定。此外，没有证据表明OxlT活性需要其他特定脂质。用TIP3P水分子和150 mM KCl溶剂化蛋白质-膜系统，导致z维长度为100 Å。然后，所有 87 厘升–使用琥珀色工具替换为 58 个草酸盐离子1773通过考虑溶液中草酸盐模型的缩放有效电荷（–1.5e）来改变总电荷（参见下面的ECCR）。最终的MD系统分别包含146015和143611原子，用于闭塞和朝外的OxlT系统。然后使用 NAMD 2.12 进行 MD 仿真74.琥珀色ff14SB和脂质14力场分别用于描述蛋白质和膜75,76.使用基于Kroutil等人开发的Ab Initio分子动力学模拟的电子连续校正与重垢（ECCR）确定的参数描述了溶液中的草酸盐配体。43,77.OxlT结合位点中的草酸盐配体使用约束静电势（RESP）方案确定的参数进行描述78无需应用ECCR校正，考虑到蛋白质环境与水溶液的环境不同。RESP费用已由前厅软件计算79.据我们所知，目前还没有研究模拟草酸盐与蛋白质络合，尽管一些MD研究已经模拟了草酸盐阴离子的大量溶剂化，其与钙阳离子的络合以及吸附表面过程80–82.MD 系统的设置最小步数为 10，000 步，在 NVT 集合中以每度 0.10 ns 的步长从 0 到 1 K 加热，然后在 NPT 中以每 10 度 310.0 ns 的步长加热到 2 K，在 30 K 下通过 NPT 集合模拟进行 10 ns 的平衡。然后，在NPT条件下对闭塞和向外的OxlT（对于Lys310的每个质子化状态）系统分别进行了1.0和1.7 μs的生产运行。使用朗格文恒温器保持355 K的温度，使用Nosé-Hoover Langevin活塞将压力设置为310个大气压。应用周期性边界条件，采用粒子网格Ewald方法处理长程静电相互作用，实际空间截止为1 Å，开关函数为12 Å。积分时间步长为 10 fs。

为了建立甲酸盐模拟系统，将指向Lys355的草酸盐羧酸盐部分替换为草酸盐结合闭塞结构中的氢原子，以生成甲酸盐-OxlT配合物的初始结构。此外，从先前的模型中去除了K离子，并用水分子代替，以解释负电荷的损失。加夫力场参数+79用于甲酸盐。执行与上述相同的平衡和生产方案。在平衡步骤结束时，OxlT蛋白的完全松弛保证了较小配体的结合位点的良好调整以及生产运行的现实构象。

作为模拟系统的总结，我们构建了四个系统，具有初始结构（向外开放或闭塞结构），Lys355的质子化状态和结合配体（草酸盐或甲酸盐;在闭塞结构的情况下）的不同组合。在补充表中5，总结了这些仿真系统，以及轨迹数和总仿真时间。

草酸盐与OxlT的相对结合自由能通过该计划中实施的MM / GBSA方法计算 MMPBSA.py83.在MM/GBSA方法中，结合自由能分解为气相能和溶剂化能，分别通过分子力学力场（MM）和具有溶剂可及表面积（GBSA）的广义玻恩隐式溶剂模型计算。请注意，熵效应不包括在计算中。我们分析了描述从闭塞状态到向外开放状态的构象转变的轨迹（图）。4d， f和补充图。13一).轨迹分为三个阶段：草酸盐二面体~50°（0-40 ns;表示为OxlT-occ-dih50）的闭塞OxlT，草酸盐二面体~90°（41-320 ns;OxlT-occ-dih90）和草酸盐二面体~90°（321-1000 ns;OxlT-op-dih90）。测定每个轨迹阶段的MM/GBSA结合自由能（见补充表4).

模拟过程中的水密度由MDAnalysis的模块计算84在蛋白质居中并叠加之后。

质量管理/毫米计算

采用草酸盐结合结构（PDB ID 8HPK）的几种QM/MM模型来评估结合位点环境与草酸盐内部构象的相关性。首先，将草酸盐配体分配给QM部分，而将整个蛋白质分配给MM部分。其次，将直接与配体相互作用的第一个残基壳（Gln34，Tyr35，Tyr124，Arg272和Lys355）添加到QM部分。第三，将结合位点的第二个壳（Tyr150、Trp324、Tyr328和Trp352）加入到QM部分，以构建围绕草酸盐配体的完整结合位点环境。所有 QM/MM 计算均使用 ONIOM 执行85，以高斯 16 实现86.密度泛函理论（DFT）方法87,88用于在 B3LYP/6-31 + G（d，p） 理论水平上处理 QM 区域89,90，包括使用贝克-约翰逊阻尼（D3BJ）进行的格里姆色散校正91.系统的MM区域由与MD模拟相同的力场描述。使用电子嵌入方案使得MM区域极化QM电子密度。对于位于QM区域的每个残基，在α和β碳之间添加显式链接原子，以处理QM和MM部分之间的共价边界。势能面的最小值通过没有虚数频率来确认。使用与QM/MM计算相同的QM理论水平对具有固定位点残基侧链的草酸盐配体进行额外的纯DFT计算。与QM/MM计算一样，作为势能面上的静止点获得的优化结构是真正的能量最小值，没有虚部频率。

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