复旦大学教授载文AFM封面：细胞外囊泡促进骨再生的最新研究

日前，复旦大学口腔医学院刘月华教授和复旦大学高分子科学系俞麟教授合作揭示的“可注射生物活性水凝胶负载细胞外囊泡促进骨再生”，即经低氧处理BMSCs得到的低氧细胞外囊泡（Hypo-EVs）结合生物活性水凝胶治疗骨缺损的研究成果，以“Versatile Hypoxic Extracellular Vesicles laden in an Injectable and Bioactive Hydrogel for Accelerated Bone Regeneration”为题在国际知名的材料科学顶级期刊《Advanced Functional Materials》（《先进功能材料》）发表，并被选为AFM期刊封面文章。

口腔医学院邓佳佳博士和高分子科学系王欣博士为该文章共同第一作者，口腔医学院刘月华教授、於丽明博士和高分子科学系俞麟教授为本文共同通讯作者。

间充质干细胞（MSCs）是一种研究广泛的具有自我更新和多向分化能力的多能干细胞。其中，骨髓源性间充质干细胞（BMSCs）在骨重塑中起着至关重要的作用。然而，由于干细胞移植到体内后细胞活力降低，分化能力受损以及潜在的免疫排斥和肿瘤形成等风险，限制了BMSCs在骨再生中的应用及其临床转化。

越来越多的研究表明，MSCs的治疗作用主要通过旁分泌机制，来源于MSCs的细胞外囊泡（EVs）在其中扮演着关键角色。在正常生理条件下，骨髓中的氧浓度只有1% ~ 6%，这意味着体内的BMSCs实际处于乏氧的微环境中。迄今为止，仍不清楚乏氧预处理是否能够改善BMSCs来源的EVs功能，是否更有利于骨缺损的修复。

该研究旨在阐明低氧处理对BMSCs生物学行为的影响以及EVs分泌的调节作用及其机制，并考察其在颅骨损伤后的修复效果。研究人员首先确定了低氧处理细胞的氧浓度，证实1%O2处理对BMSCs的活性无损伤作用，且转录组数据表明该低氧处理还显著上调了干细胞内与EVs分泌、细胞外基质（ECM）形成、成骨分化和成血管分化等相关基因的表达。随后，研究人员通过超速离心法获得了Hypo-EVs，并发现低氧处理显著促进了Hypo-EVs的分泌，提高了Hypo-EVs中的蛋白含量。为了研究这种Hypo-EVs的生物学功能，研究人员分离提取了颅骨成骨细胞（ROBs），通过大量体外实验证实Hypo-EVs能够显著促进ROBs增殖、迁移和成骨分化。进一步的蛋白组学分析显示，Hypo-EVs可能通过PI3K/AKT信号通路促进ROBs的成骨表型，并利用AKT抑制剂确认了这一结论。

图片说明：Hypo-EVs通过激活PI3K/AKT信号通路促进成骨细胞功能

为了保持EVs在体内的生物活性并实现持续的递送，研究人员开发了一种由聚乙二醇-聚多肽共聚物组成的可注射生物活性水凝胶。体外细胞实验证实该水凝胶材料具有促进ROBs和BMSCs增殖的活性。体内实验显示这种聚多肽水凝胶具有良好的生物相容性和适宜的降解性能，能够很好地匹配体内骨缺损的修复过程。

随后，研究人员将负载了Hypo-EVs的聚多肽水凝胶注射到大鼠5 mm直径的颅骨缺损区，通过Micro-CT观测和组织学检测确认Hypo-EVs在体内的持续释放结合水凝胶本身的生物活性加速了缺损部位的骨再生。

由于EVs内富含多种蛋白质，为了确定这些蛋白在骨再生中的作用，研究人员通过蛋白组学技术分析了EVs内蛋白表达差异。

结果表明，Hypo-EVs内与成骨分化相关的多种蛋白高表达，其中一个高表达的蛋白是与ECM相关的蛋白多糖Bgn。研究人员通过Bgn过表达和敲降的细胞实验进一步证实Bgn蛋白是一个调节成骨细胞分化和矿化的关键蛋白。

该研究阐明了低氧细胞外囊泡（Hypo-EVs）在骨修复中的积极作用，首次揭示Bgn蛋白通过旁分泌机制参与了骨缺损的修复。

图片说明：生物活性水凝胶负载Hypo-EVs促进骨修复的示意图

综上，本研究不仅揭示了BMSCs来源的Hypo-EVs在骨修复中的作用，而且开发了一种能够增强EVs治疗效果的递送平台。

由于其操作简便，该治疗策略还有望推广到其他疾病的治疗，成为非细胞治疗的一个典范。    

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