7+！单细胞测序揭示人椎间盘退变中软骨细胞亚群与铁死亡机制~

导语

髓核 (NP) 在椎间盘退变的发病机制中起着核心作用，然而，作为异质组织，NP 中的细胞亚群及其在椎间盘退变 (IVDD) 中的相应生物学过程尚未见报道。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者通过scRNA-Seq 在髓核中发现了新的软骨细胞亚群，并发现Ferroptosis参与了椎间盘退变的发病机制。文章发表在《Osteoarthritis and Cartilage》上，影响因子为7.507，文章题目为：Single-cell RNA-seq analysis identifies unique chondrocyte subsets and reveals involvement of ferroptosis in human intervertebral disc degeneration。

数据介绍

本研究从1例正常对照和5例 IVDD 中分离出髓核，进行单细胞 RNA 测序。

技术路线

本研究技术路线如图所示。  

结果解析 

01 scRNA-seq揭示NP中的不同细胞类型  

经过滤，本研究保留了 30,300 个细胞用于下游分析 ，每个细胞平均有 1,671 个基因和 6,089 个 UMI 用于进一步分析（图1A）。来自不同供体的 NP 组织通过 MRI 和形态学测试来表征 （图1B，C）。使用 Seurat 包的无监督聚类在所有三个组中确定了五个不同的细胞簇 （图1D，E）。簇 1（约占所有细胞的 99.33%）包含表达 ACAN、COL2A1、SOX9、FMOD 和 COMP 的软骨细胞。簇 2（约占所有细胞的 0.57%）包含表达 LYZ、CD14、IL1B、TNF 和 MRC1 的巨噬细胞。簇 3（约占所有细胞的 0.10%）包含表达 CDH5、PECAM1 和 CLDN5 的内皮细胞 (EC)（图1F-H）。据报道，在 IVDD 的过程中，NP 的无血管性质会转变为血管化。同样本研究的 scRNA-seq 仅在 IVDD 样本中揭示了 EC，并且该比例随着疾病的严重程度而增加（图1E）。

图 1

02 scRNA-seq鉴定出七个软骨细胞亚群  

软骨细胞作为主要类型，在NP的正常功能中起着重要作用。因此本研究更仔细地观察了 Cluster 1 软骨细胞，以确定子集频率或类型是否在不同组之间发生了变化 ，结果发现了三个经验定义的群体和四个新群体（图2A）。其中，纤维软骨细胞祖细胞（FCPs）和C3相对罕见（图2B）。具体而言，鉴定了以下细胞：(1) FCPs，表达 MYLK 和 COL3A123，(2) 软骨祖细胞（CPCs，表达 BIRC5， CDK1、CENPU、DHFR 和 STMN1)，(3) 稳态软骨细胞（HomCs，表达 JUN、BRD2、RGS2 和 CCNL1），(4) C1 高表达 MGP、FGF2 和 CD55， (5) C2 高表达 PRG4、COL2A1、MSMO1、VCAN 和 SCRG1)，(6) C3 高表达 CXCL1、MMP13、COL12A1、AEBP1 、TNC 和 CD44，(7) C4 高表达 COL1A1、COL3A1、LGALS1 和 MMP14（图2C-E）。为了验证四个新发现的子集，本研究对患者样本进行了免疫组织化学染色。

图 2

03 GO和KEGG分析揭示了富含软骨细胞亚群的通路  

为了研究七个软骨细胞亚群中已识别的 DEG 的潜在功能，本研究进行了基因本体论 (GO) 和京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 分析。分析表明，富含 C1 的 MF 相关 GO 通路与细胞因子活性相关，并且 C1 簇可能参与血管生成（图3A）。C2 显示与细胞外基质结构成分、赋予拉伸强度的细胞外基质结构成分和抗压性更相关（图3A），这些结果表明 C2 可能在传感机械转导中发挥作用。C3 和 C4 表现出相似的 MF，例如胶原蛋白结合、细胞粘附分子结合和整合素结合，这对细胞外基质组织很重要（图3A）。GO 分析还显示 NP 中的 CPC 具有染色体分离、核分裂和细胞周期活动的暗示能力（图3A）。结果中的 GO 分析显示 FCP 中的 MF 与蛋白质加工有关（图3A），HomCs 可能在蛋白质代谢中发挥重要作用（图3A）。

图 3

本研究进行 KEGG 分析以显示不同组之间已识别的 DEG 的功能。有趣的是，与对照组或重度 IVDD 组相比，与铁死亡相关的基因在轻度 IVDD 组（FTL、HMOX、CP）中显著富集（图3B,C）。基因集富集分析 (GSEA) 分析还显示，与 NC 相比，IVDD 组的 C2、C4、CPC 和 HomC 中的铁死亡信号上调（图3D）。这些结果表明铁死亡参与了椎间盘退变的发病机制。

04 伪时间分析与细胞间通讯  

为了研究不同子集的分化和相应的基因表达，本研究选择了 CPCs、FCPs、HomCs 和 C1eC4 子集来构建包含两个末端对应的新轨迹 （图4A）。CPC主要分布在轨迹的根部，FCP出现在中后期。FCP 和 C3 主要分布在命运 1 中，而 C1、C2、C4 和 HomC 分布在两种命运中（图4B）。

图 4

接下来本研究进行了细胞间通讯分析。结果发现 C2 与 C4 有很强的联系，有超过 140 次交互。C2、C4 和 HomC 显示出与 M2 巨噬细胞的相似相互作用。此外，C2 还通过近 100 次交互连接到 C3（图4C）。这些数据表明 C2 可能在 NP 的微环境中发挥核心作用，NP 负责与多个细胞亚群进行通信。具有显著相互作用的配体和受体部分显示在图 4D 和 E)中。数据显示，与 C2、C3 和 C4 子集相比，C1 子集与巨噬细胞（M1 和 M2）的细胞通讯更多。同时，C4 子集与 EC 的交互比其他子集更多。这些结果表明不同的细胞亚群可能在炎症和血管生成中发挥微妙的作用，针对关键细胞亚群的靶向干预可能是未来IVDD精准医学治疗的希望。

05 铁死亡参与IVDD发病机制  

考虑到铁死亡相关基因在轻度患者组中的高表达，本研究用双足大鼠建立了一个中度 IVDD 模型以验证scRNA-seq 结果。MRI 用于确认 IVDD 模型构建的成功 （图5A）。进行 H&E 染色和 SeO 染色以了解椎间盘的形态变化。结果显示，IVDD 大鼠的软骨终板和 AF 之间的空间缩短了（图5B），IVDD 大鼠 NP 区域的细胞数量也减少（图5B）。此外，红色区域减少和绿色区域增加表明 IVDD 大鼠中的蛋白多糖含量较少（图5C），这进一步证实了大鼠模型中椎间盘的退化。使用铁测定试剂盒测定椎间盘组织的铁水平，发现 IVDD 大鼠的 NP 组织中铁水平显著增加（图5D）。这表明铁在 IVDD 的 NP 组织中积累，这是铁死亡的标志。此外，本研究评估了椎间盘组织中 FTL 和 HO-1 的水平（图5E，F），它们是参与铁死亡的两个重要调节因子。结果发现在来自 IVDD 样本的 NP 组织中，FTL 被下调而 HO-1 被上调。综上所述，这些结果表明铁死亡参与了 IVDD 的发病机制。

图 5

小编总结

本研究通过 scRNA-Seq 在髓核中发现了新的软骨细胞亚群，这为了解 IVDD 发展过程中的病理变化提供了新的见解。Ferroptosis参与椎间盘退变发病机制，或可作为干预IVDD的新靶点。

本研究具有一些局限性，强调需要进一步优化。本研究的 scRNA-Seq 数据集建立在小的健康样本上，由于患者的特殊性，这可能会影响结果的解释，在后续研究中需要更多的样本。其次，细胞相互作用的数据已经初步呈现，但其中包含的更多信息还需要深入研究，相应的结果也需要进一步的生物学实验来验证。第三，虽然本研究已经证实了 IVDD 大鼠模型铁死亡的表型，但潜在的信号通路和靶向铁死亡在干预 IVDD 中的作用需要进一步阐明。

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