纳米颗粒｜基于蛋白质平台的抗原递送

前言

生物制品中的纳米颗粒定义是粒径在1nm-100nm，或小于1000nm时表现出与其尺寸相关的物理、化学、生物效应的物质。由于纳米颗粒与细胞组分的大小相似，因此可以通过胞吞作用，进入活细胞。在疾病预防和治疗方面，纳米颗粒可被用作递送系统以增强抗原识别或作为免疫刺激剂来促进免疫反应。上一期内容介绍了在抗原免疫中常用的纳米颗粒，本期小编将为大家介绍纳米颗粒在分子水平上如何影响免疫应答、抗原连接方式和设计策略。

纳米颗粒平台可提高抗原的免疫应答

抗体的产生需要通过抗原呈递细胞（APC）激活T细胞，然后由抗原和激活分化后T滤泡辅助细胞（TFH）激活B细胞。这个过程中B细胞需要两个信号才能分化为成熟的高亲和力IgG浆细胞。第一个信号是B细胞受体（BCR）识别直接进入淋巴结或由APC呈递的抗原，通过BCR将抗原内吞，然后呈递处理过的抗原在表面上。第二个信号是TFH细胞识别B细胞呈递的抗原并激活B细胞成熟为产生IgG的浆细胞。

图1. 纳米颗粒抗原递送平台引发机体免疫反应的机制示意图[1]。

纳米颗粒抗原复合物皮下或肌肉注射后，可以产生一个抗原储备库，称为沉积效应，来招募和激活APCs，而激活的APCs则会归巢至淋巴结 (图1)。此外，纳米颗粒抗原也可以通过淋巴循环直接到达淋巴结，激活驻留的APCs。然后，淋巴结中的激活APCs可以通过主要组织相容性复合体MHC II分子呈递抗原，将CD4 T细胞转化为辅助T细胞(Th1和Th2)。Th2细胞可以促进B细胞分化为产生抗体的浆细胞。

纳米颗粒有助于抗原到达淋巴结

抗原主要通过两种方式进入淋巴结：

（1）被抗原呈递细胞（APC)，如树突状细胞和巨噬细胞所捕获，然后转移到淋巴结。

（2）抗原通过细胞外基质转移到淋巴管然后通过循环到达淋巴结。纳米颗粒可作为抗原储备库，在注射部位持续招募和激活抗原呈递细胞将抗原并以上述其一或两种方式递送至淋巴结。

纳米颗粒有助于B细胞IgG的产生

纳米颗粒通过两种方式促进抗体的产生

（1）将抗原附着在颗粒上，保持总体颗粒大小在APCs高效摄取的最佳大小范围，颗粒也可以有效地与补体结合，进而延长其在淋巴滤泡中的滞留时间，并增强其对B细胞的抗原呈递（图2a)。

（2）载体表面上重复展示的抗原可以通过与多个BCR高效交联来促进B细胞激活（图2b）。

除了通过上述两个特征增强B细胞激活之外，异源的纳米颗粒本身即可作为佐剂促进免疫系统识别的反应。因此，蛋白质纳米颗粒平台使得通常分散的抗原能够打破耐受性并引发免疫反应。

图2. 蛋白质纳米颗粒的优势[2]。

黄色的二十面体代表蛋白质纳米颗粒平台，绿色的圆形部分代表基因融合表达的抗原。

a.抗原-纳米颗粒平台大体积复合物的优势之一是增强了补体（橙色矩形框）结合，纳米颗粒包被补体后更容易结合到APC表面的补体受体上，如滤泡树突状细胞，并促进包被纳米颗粒在淋巴结内停留，和增强APC对纳米颗粒的摄取，如浅蓝色的圆形空洞和箭头所示。

b.通过与B细胞膜上嵌入的多个抗原结合来增强B细胞的活化。

基于蛋白质的纳米颗粒平台

与其他纳米载体（如聚合物、脂质和无机纳米颗粒）相比，基于蛋白质的纳米颗粒具有更多的优势，包括生物相容性、生物功能性、在生物环境中的分子识别能力、丰富的可再生来源和能够生物降解成小分子氨基酸。更重要的是，蛋白质纳米颗粒可以进行精确的基因工程，将具有特定位置的功能位点用于特定的细胞靶向和蛋白质传递。多功能多肽与治疗化合物之间的不同相互作用可实现各种药物的超强结合能力。制备基于蛋白质的纳米颗粒有两种主要方法，即自组装和脱溶法。迄今为止，已经从动植物中提取出许多种蛋白质作为基质来制备蛋白质纳米颗粒，包括胶原蛋白、明胶、白蛋白、酪蛋白、弹性蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、丝素蛋白、鸟嘌呤核苷和凝集素[1]。

抗原和蛋白质纳米颗粒的连接方式 

将抗原附着在蛋白纳米颗粒上主要有三种不同的方法：化学偶联、基因融合和标签偶联（图3）。这些方法可以在纳米颗粒上连接大量抗原，从而增加展示和整体大小。共价结合依靠化学处理将抗原交联到纳米颗粒平台上，然而，化学共价结合的不均匀连接可能会导致抗原显示不佳，但该方法已被证明能够显著提高免疫应答。基因融合和标签偶联可以通过位点特异性的抗原附着提供更高的连接精准度。基因融合是将抗原直接连接到纳米颗粒平台上最直接的方法，但需要抗原与纳米颗粒蛋白进行融合表达，但是有可能导致抗原或纳米颗粒的不正确折叠。与之相比，标签耦合系统允许抗原的独立表达和模块化附着，常用的标签耦合系统包括Biotin-Avidin, HaloTag, and SpyTag/SpyCatcher。

图3. 抗原-纳米颗粒连接的方法[2]。

设计纳米颗粒平台时需要考虑的关键参数

研究表明，颗粒佐剂的物理化学特性，如大小、表面特性（电荷、亲疏水性和表面修饰）、形状和弹性，都可能影响颗粒的佐剂效应，包括细胞摄取效率、进入抗原提呈细胞的途径以及MHC I和II分子呈递抗原肽段的方式，以及随后的B/T细胞免疫反应。

纳米颗粒尺寸大小

颗粒大小影响抗原的淋巴结递送效率。小尺寸的颗粒(<50nm)可以通过直接穿过淋巴系统的紧密屏障更有效地运输到淋巴结，并且在淋巴结内停留时间更长，而大尺寸的颗粒(>50nm)需要DCs将其穿梭到淋巴结中。直径为50nm和100nm的颗粒在淋巴滤泡中停留时间为5周，而直径为5和15nm的颗粒则为48小时。

APCs识别方面，通常与病原体大小相当的颗粒容易有效地被APC识别和吞噬。直径小于250nm的颗粒（大多数蛋白质平台在这个范围内），利用clathrin和受体依赖的摄取途径。直径小于500nm的颗粒利用树突状细胞摄取，直径大于500nm的颗粒主要由巨噬细胞摄取。此外，较大的颗粒更有可能呈现在FDC表面，使抗原更容易传递给B细胞，并促进更高水平的B细胞成熟。但是，直径小的颗粒比大直径颗粒能够更有效地进入淋巴结。

因此，最佳平台大小应当在20-50nm左右，这个范围既能实现高效摄取、长时间的淋巴滤泡停留时间，并且能够有效地进入淋巴结（图4a）。

纳米颗粒形状

在纳米颗粒和APCs之间的相互作用中，颗粒形状同样扮演着重要的角色。通常情况下，颗粒佐剂的形状为球形，但随着粒子工程的发展，出现了各种形状，例如棒形、棱柱形、立方体、星形、圆盘形、扁平形和长形等。目前已有许多研究表明，粒子的形状对细胞摄取具有显著影响。然而，对于颗粒形状和佐剂作用有何影响并没有明确的结论。一些研究发现，与球形颗粒相比，非球形粒子不容易被细胞摄取，且长宽比与摄取速率呈负相关，细胞对吸附非球形粒子的较大平均曲率半径。然而，Huang等人发现，相对于球形粒子，长宽比更大的介孔棒状二氧化硅纳米颗粒被摄取的效率更大，内化速率更快[1]。许多研究也表明，粒子形状对抗原呈递和免疫细胞的后续处理同样重要，球形金纳米颗粒（AuNPs）（40nm）比其他形状（立方体和棒状）或20nm大小的AuNPs能更有效地诱导抗体产生，即使棒状AuNPs（40nm×10nm）比球形和立方体AuNPs更有效地被APCs摄取[3,4]。

抗原的价数和间距

B细胞的最佳激活依赖于抗原的价数和间距。一项研究比较了单价HIV gp120抗原eOD-GT和多价的抗原-蛋白纳米颗粒，发现对比单价抗原，8-mer和60-mer抗原能增强B细胞激活和增殖，并提高T细胞招募和IgG滴度。然而，低价数的抗原可能产生更高亲和力的B细胞（图4b、c）。

图6. 最佳的纳米颗粒大小、抗原价数和间距范围强度从左（不理想）到右（理想）逐渐增加

a. 为了获得最佳的免疫原性，纳米颗粒的最佳大小需要综合考虑三个关键因素：高效的细胞内吞噬、淋巴滤泡保留以及淋巴结的有效进入。随着颗粒尺寸的增加，有利于增强APC对抗原的胞吞和递呈，但是会抑制纳米颗粒进入淋巴结。最佳平台大小可能在20-50nm之间。

b. B细胞的激活和增殖会随着抗原价数的增加而增强c. 为了促进高效的B细胞激活，抗原之间的距离也需要在理想范围内。抗原之间距离小于28nm时，可能存在空间位阻效应阻碍BCR与抗原结合。

其他因素

除了尺寸和结构之外，表面电荷和疏水性也会影响颗粒的转运，从而影响免疫原性。正电荷颗粒与负电荷膜之间存在静电吸引力，可促进抗原颗粒被APC的摄取。另外，疏水颗粒比亲水颗粒具有更高的免疫响应，疏水颗粒可通过增强细胞膜相互作用或补体招募而促进APC对抗原的摄取。然而，抗原的附着会显著改变颗粒的表面性质，因此需要在抗原纳米颗粒结合的形式下评估平台表面电荷和疏水性如何影响转运和免疫反应。

总结

疾病相关抗原进行动物免疫有时会出现低水平抗体产生的情况，可能原因在于抗原递送效率低无法招募和激活APC，或抗原免疫原性太低无法产生足够的免疫反应。使用佐剂或优化抗原递送方式都有助于提高机体对抗原的免疫应答和促进抗体产生。与传统佐剂相比，纳米颗粒的多重角色，作为佐剂和抗原递送载体都具有许多优势。纳米颗粒平台能够提高抗原稳定性，与抗原结合后免疫动物，可以提高APC对抗原的摄取和递呈，促进淋巴结转移和激活高效体液免疫应答，有助于B细胞IgG的产生。阿帕克生物有丰富的疾病相关抗原的纳米抗体开发项目经验，欢迎咨询与合作交流！

参考文献：

[1].Cui Song, Feng Li, et al. Recent Advances in Particulate Adjuvants for Cancer Vaccination. Adv. Therap. 2019, 1900115. doi: 10.1002/adtp.201900115.

[2].Nguyen B, Tolia NH. Protein-based antigen presentation platforms for nanoparticle vaccines. NPJ Vaccines. 2021 May 13;6(1):70. doi: 10.1038/s41541-021-00330-7.

[3].Qin X, Yu C, Wei J, Li L, Zhang C, Wu Q, Liu J, Yao SQ, Huang W. Rational Design of Nanocarriers for Intracellular Protein Delivery. Adv Mater. 2019 Nov;31(46):e1902791. doi: 10.1002/adma.201902791.

[4].Zhao L, Seth A, Wibowo N, Zhao CX, Mitter N, Yu C, Middelberg AP. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 2014 Jan 9;32(3):327-37. doi: 10.1016/j.vaccine.2013.11.069. 

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