益生菌复合制剂对肝脏抗氧化能力、肠道微生态环境的影响

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物的总称。当人体摄入足量的益生菌后，这些益生菌可以抑制致病菌的生长，增殖有益菌，调节肠道酸碱度，维护肠道黏膜屏障完整性等方式，促进身体的健康[1-2]。益生菌因其独特的保健功能，在食品领域有着广泛的应用前景。我国可用于食品的益生菌有38种，主要包括双歧杆菌、乳酸杆菌、链球菌和乳球菌等。此外，还有13种益生菌已被批准用于婴幼儿食品。

不同的益生菌有不同的作用，多种益生菌联合使用效果优于单一菌种。双歧杆菌和乳酸杆菌是目前可添加到食品中的两种重要益生菌。因此，双歧杆菌和乳酸杆菌的复合制剂已成为功能性食品领域的研究热点。在这项研究中，益生菌复合制剂组成的乳酸双歧杆菌V9，植物乳酸杆菌P9和干酪乳杆菌为研究对象，探讨其对小鼠细胞因子、抗氧化能力、肠道菌群及其代谢产物的影响，以期为益生菌复合制剂的研发提供更多依据。

1.材料与方法

1.材料

1.1材料：

1.1.1试剂

①益生菌复合制剂（活菌数为2X1011CFU/g，乳酸双歧杆菌V9占60%，植物乳杆菌P9占20%，干酪乳杆菌占20%）。

②EMB琼脂培养基，叠氮化钠-结晶紫-七叶皂苷琼脂培养基，LBS琼脂培养基，必和必拓琼脂培养基，TSC琼脂培养基。

③白介素2（IL-2）、白细胞介素6(IL-6)、白介素1£(IL-1)、肿瘤坏死因子a(TNF-a) ELISA试剂盒。

④丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（T—SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）检测试剂盒。

⑤雄性BALB/c小鼠44只，4周龄，体重18—20g，饲养条件为每天光照12h，温度20±2P，湿度45%～60%。

1.1.2工具

InfiniteM200Pro多功能微孔板阅读器；5425R台式离心机；NU-9483E超低温冰箱；RS220CHUV超纯水机；FA2004N电子分析天平；MS3涡旋振荡器；NHS-100HC恒温恒湿培养箱；V—1600可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1动物的分组和给药

44只4周龄雄性BALB/c小鼠，适应性饲养7天后，随机分为空白对照、低剂量组、中剂量组、高剂量组，空白对照组灌胃生理盐水，各剂量组灌胃对应剂量的益生菌复合制剂，共计28天。

实验期间每天称量小鼠摄食和体重，实验结束后保存、称重计算所有小鼠脏器系数，保留空肠和肝脏放置于超低温冰箱中。

1.2.2益生菌复合制剂对小鼠血清细胞因子的影响

取小鼠眼球，取血置于1.5mT离心管中，4摄氏度，4000rpm离心10min，取上清0.2mL，检测IL-2、IL-6、IL-10和TNF-a水平。具体操作步骤均严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.3益生菌复合制剂对小鼠空肠和肝脏中抗氧化物质的影响

比色法测定小鼠肝脏和空肠中MDA、T—SOD、GSH、GSH—Px的含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书执行。

1.2.4肠道菌群计数

第0天（益生菌复合制剂灌胃前）和第28天，收集小鼠粪便约0.04g，加入稀释液摇匀，连选择在37P培养基上培养24小时。肠球菌选用叠氮钠-结晶紫-七叶皂苷培养基，37P培养48小时。在LBS琼脂培养基上筛选FuL.芽孢杆菌，37℃培养48小时。双歧杆菌选择性必和必拓琼脂培养基，37P厌氧培养48小时。选择TSC琼脂培养基进行产菌，计算37℃厌氧培养24小时后每克湿粪便的菌落数（1gCFU/g）。

1.2.5益生菌复合制剂对小鼠粪便中短链脂肪酸的影响

用气相色谱法测定小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量。参考Han[6]等的方法并加以改良，进行气相色谱分析。

分析条件为：选用DB-FFAP毛细管柱作为色谱柱。载气为氮气，纯度为99.99%。初始温度为40P，以10%3/min的温度上升到200P，保持3min，探测器温度为270°C。

1.3数据处理

对实验数据进行预处理，对脏器系数、细胞因子和抗氧化剂数据进行单因素方差分析。计数采用独立样本检验，P＜0.05表示有统计学差异，P＜0.01表示无统计学差异，P＞0.05表示无统计学差异，所有结果均以均数±标准差。

2.研究结果

2.1益生菌复合制剂对小鼠体重及摄食量的影响

各组小鼠的摄食量和体重如图1所示。随着年龄的增加，小鼠的摄食量和体重呈稳步上升的趋势，但各组间的摄食量和体重差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，益生菌混合制剂对小鼠的摄食量和体重无明显影响。

2.2益生菌复合制剂对小鼠脏器系数的影响

各组小鼠各脏器系数均无统计学差异，表明益生菌复合制剂对小鼠各脏器无影响。

2.3益生菌复合制剂对小鼠血清细胞因子的影响

细胞因子是一类能在细胞间传递信息，具有免疫调节功能的蛋白质或小分子多肽。一般情况下，它们能帮助人体排除病原体，增强免疫力。然而，过量的细胞因子会诱发炎症反应，形成细胞因子风暴，对组织和器官造成损害[7]。IL-2主要由T细胞或T细胞亚群产生，可诱导B细胞、T细胞和NK细胞的增殖和分化[8]。IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞和纤维细胞产生。当机体受到细菌或病毒的侵袭时，会诱导机体产生大量的IL-6来应对侵害[7]。IL-1/B和TZF-a主要由活化的单核-巨噬细胞产生，广泛参与代谢紊乱、肿瘤及各种炎症反应[10-12]。

正常情况下，上述四种细胞因子的水平都处于较低水平。如果水平过高，就意味着身体产生了炎症反应，可能会对组织或器官造成损害。由图2可知，与空白对照组相比，低剂量组IL-1/B水平极显著降低（PV0.01）,中剂量组IL-2水平显著降低（PV0.05）且IL-6和IL-1B水平极显著降低（P<0.01）,高剂量组IL-2、IL-6、IL-lB水平极显著降低（P<0.01）,TNF-a水平显著降低（PV0.05）,说明益生菌复合制剂可以有效地降低了这4种细胞因子的水平，在抑制炎症方面有一定的作用。

2.4益生菌复合制剂对小鼠空肠和肝脏抗氧化能力的影响

新陈代谢是机体必不可少的生命活动。合成和分解过程中往往会产生大量的自由基，对细胞造成氧化应激损伤。因此，身体经常通过产生SOD、GSH和GSH-Px等保护酶来消除有害物质[13-15]。MDA是体内膜脂质过氧化的产物之一，其水平往往与生物膜的氧化损伤程度呈正相关[16]。

实验结果表明，与空白对照组相比，低剂量组小鼠空肠MDA含量显著降低（P＜0.05），中高剂量组极显著降低（P＜0.01）。与空白对照组比较，中剂量组T-SOD水平显著升高（P＜0.05），高剂量组极显著升高（P<0.01）。与空白对照组相比，高剂量组GSH水平显著升高（P＞0.05）。与空白对照组比较，中、高剂量组GSH-Px水平显著升高（P＜0.01）。在肝脏中，各剂量组的MDA水平与空白对照组相比无统计学差异（P＜0.05）。与空白对照组比较，中、高剂量组T-SOD水平显著升高（P<0.01）。与空白对照组比较，中剂量组GSH水平显著升高（P<0.05），高剂量组极显著升高（P<0.01）。与空白对照组比较，中、高剂量组GSH-Px水平显著升高（P<0.01）。以上结果表明，益生菌复合制剂灌胃不同剂量后，空肠和肝脏中三种抗氧化物质的水平均明显升高，且呈一定的剂量依赖性，说明益生菌复合制剂对提高小鼠抗氧化能力有一定的作用。

2.5菌落计数

益生菌复合制剂灌胃28天后，菌落计数结果显示，中剂量组乳酸杆菌和双歧杆菌数量较空白对照组显著增加（P<0.05）。与空白对照组比较，高剂量组乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著增加（P<0.01）；中剂量复合益生菌制剂中乳酸杆菌和双歧杆菌数量较试验前显著增加（P<0.05）。

与试验前相比，饲喂高剂量复合益生菌制剂后，乳酸杆菌数量显著增加（P<0.01），双歧杆菌数量显著增加（P<0.05）。各剂量组肠杆菌科、肠球菌和产气荚膜梭菌数量均无明显变化，与空白对照组比较无显着性差异(P>0.05)。双歧杆菌V9作用21天后，粪便中双歧杆菌数量明显增加，便秘症状明显减轻[17]。此外，研究人员[18]发现，摄入干酪乳杆菌可有效增加人体肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的数量，改善肠道功能。验结果表明，给小鼠服用益生菌复合制剂后，乳酸杆菌和双歧杆菌的数量明显增加，对调节肠道菌群起到了重要作用。

2.6益生菌复合制剂对小鼠粪便中短链脂肪酸的影响

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是肠道微生物发酵膳食纤维时产生的代谢产物对于缓解炎症性肠病、维持肠道黏膜屏障完整性、能量代谢有着重要帮助，测定机体粪便中的SCFAs的种类和含量 、对机体肠道微生物和内环境的研究有着重要意义[19]。乙酸、丙酸和丁酸是肠道中含量最多的SCFAs，其中乙酸主要由埃克曼氏菌、拟杆菌、双歧杆菌、普雷沃氏菌、胃肿瘤等通过乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径产生，主要用于脂肪和胆固醇的合成。丙酸盐主要由拟杆菌属和梭菌属通过琥珀酸途径和丙烯酸酯途径产生，经血液循环进入肝脏参与脂肪代谢，降低血清脂质水平。丁酸盐主要由粪球菌通过丁酸激酶或乙酸辅酶A转移酶途径产生。是结肠上皮细胞的主要能量来源，对其增殖和分化起着重要的调节作用。

在本研究中，与空白对照组相比，低、中、高剂量组乙酸含量均显著升高（P＜0.01）。与空白对照组比较，高剂量组丙酸含量显著增加（P＜0.01），丁酸含量显著增加（P＜0.05）。各组间异丁酸和异戊酸含量无显著性差异（P＞0.05）。本试验结果表明，益生菌复合制剂的干预可以提高小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

研究结论

本次研究了由乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P9和干酪乳杆菌zhang组成的复合益生菌制剂对小鼠血清细胞因子、空肠和肝脏抗氧化能力、肠道微生物和SCFAs的影响。

研究发现，口服益生菌复合制剂28天，可降低小鼠空肠和肝脏中丙二醛的含量，提高血清TSOD、GSH、GSH—Px水平，降低血清IL—2、IL—6、IL—ip、TNF—a水平，使肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌数量显著增加，乙酸、丙酸、丁酸含量增加。该益生菌复合制剂对提高小鼠抗氧化能力，降低细胞因子水平，改善肠道微生态环境，促进健康具有一定的有益作用。

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