Cell | 揭示逆转座子在基因组上跳跃的分子机制

2023-06-12 09:32 39健康

逆转录元件是广泛存在的跳跃元件，被认为是基因组进化的主要驱动力，也可以被重新利用为基因编辑工具。

2023年6月9日，清华大学刘俊杰和王家共同通讯在Cell 在线发表题为“Structural RNA components supervise the sequential DNA cleavage in R2 retrotransposon”的研究论文，该研究确定了具有核糖体DNA靶RNA和调控RNA的真核R2逆转座子的冷冻电镜结构。结合生化和测序分析，该研究揭示了识别和切割所必需的两个DNA区域，Drr和Dcr。

调控RNA与R2蛋白的结合加速了第一链的切割，阻断了第二链的切割，并开始了从3’尾部开始的逆转录。通过逆转录去除3 '调控RNA允许5 '调控RNA结合并启动第二链切割。综上所述，该研究工作解释了DNA识别和RNA监督的序列逆转录转座子R2机制，为逆转座子和应用重编程提供了见解。

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逆转座子是一类可以通过“复制-粘贴”的方式在基因组上发生跳跃的DNA元件。R2是低等真核生物中广泛存在的一种逆转座子。它们专一性地“寄生”在宿主基因组的28S核糖体DNA中，借助宿主基因的启动子，合成自身的mRNA和蛋白质并组装形成R2复合物（“复制”过程）；R2复合物可再次识别宿主28S核糖体DNA上的专一性位点，通过核酸酶（Endonuclease, EN）结构域切开DNA双链，再通过逆转录酶（Reverse transcriptase, RT）结构域逆转录合成cDNA，将R2基因序列重新整合到宿主基因组上（“粘贴”过程），完成“增殖”。

有趣的是，逆转座子等可移动的DNA元件在基因组上跳跃的过程中，极大地丰富了基因组的组成，被认为在基因组进化的过程中扮演着重要的作用。因此，理解逆转座子在基因组上跳跃的分子机制将有助于思考“我们的基因组从哪里来、如何来”的问题。此外，利用逆转座子在基因组上跳跃的性质，开发新的核酸操纵工具，将具有巨大的应用前景（Science， 2023）。

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图1. 逆转座子在基因组上跳跃的示意图

研究团队发现, 位于R2 mRNA 3’端非翻译区的RNA（3’-RNA）在R2蛋白质切割DNA双链的过程中，表现出促进第一条链切割、抑制第二条链切割的作用；位于5’端翻译区的RNA（5’-RNA）则表现出降低第一条链切割、激活第二条链切割的作用；而当5’-RNA与3’-RNA同时存在时，总是表现出3’-RNA的调控作用，并且完全抑制第二条链的切割。为了进一步理解其中的分子机制，研究团队解析了R2逆转座子在3’-RNA结合状态和5’-RNA结合状态的高分辨结构。在3’-RNA结合状态中，DNA底物被蛋白质特异性识别，3’-RNA核心区域结合在RNA结合（RNA binding, RB）结构域上。在5’-RNA结合状态中，5’-RNA呈现出复杂的“三爪（three-claw）”结构，紧密的包裹住蛋白质核心。值得注意的是，5’-RNA的其中一个爪（Claw3）同样结合在RB结构域上，且生化分析表明，Claw3对激活第二条链切割是必要的。

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图2. 3’-RNA结合状态（左）和5’-RNA结合状态（右）的复合物结构

此外，研究团队用一段连接序列将5’-RNA与3’-RNA连接成一条RNA，设计了R2全长mRNA的模拟物（L-RNA），并获得了R2逆转座子在L-RNA结合状态的结构。在这个结构中，5’-RNA同样以“三爪”的形式与蛋白质核心紧密结合，但由于3’-RNA的挤占，起激活第二条链切割作用的Claw3未能与RB结构域结合。研究团队发现，L-RNA中3’-RNA与蛋白质RB结构域的结合将抑制第二条链的切割，但当提供dNTP作为原料，使逆转录可以发生后，3’-RNA在作为逆转录模板的过程中逐渐从RB结构域上解离下来，5’-RNA得以与RB结构域结合，从而激活第二条链的切割。

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图3. L-RNA结合状态的复合物结构与RNA监督DNA双链顺序性切割的示意图

综合以上分析，研究团队总结得出了R2逆转座子在基因组上跳跃的分子机制：R2蛋白质特异性识别28S核糖体DNA序列后，蛋白质RB结构域首先结合R2 mRNA上的3’-RNA，促进第一条DNA链的切割，同时抑制第二条链的切割，仅暴露出第一条链的3’-OH作为引物，从mRNA的3’端起始逆转录过程（Targte primed reverse transcription, TPRT），随着逆转录的进行，位于mRNA 3’端的3’-RNA逐渐从蛋白质RB结构域解离，对第二条链切割的抑制作用得以释放，R2 mRNA上的5’-RNA与RB结构域的结合进一步激活了第二条链的切割。由此，位于mRNA两端的结构性RNA共同监督了DNA双链切割的顺序性切割。这种严密的顺序性切割保障了依赖宿主基因表达元件的R2逆转座子进行“有效的增殖”，在28S核糖体DNA中不断产生有活性的拷贝。

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图4. R2逆转座子在基因组上发生跳跃的分子机制与意义

有趣的是，研究团队将低等真核生物的R2逆转座子与其祖先（原核生物第二类内含子，Group II intron）和哺乳动物中的LINE-1逆转座子进行了比较，发现在Group II intron向R2逆转座子及进一步向LINE-1逆转座子进化的过程中，RNA的结构性组分逐渐减少并被编码区域所取代，并且催化功能逐渐从以RNA为主导过渡到以蛋白质为主导，为理解生物大分子进化提供了新的视角。此外，LINE-1在哺乳动物基因组中广泛存在且具有逆转座活性，为基因组提供进化驱动力的同时，也为基因组稳定性和基因表达带来了重大的影响。对R2逆转座子在基因组上跳跃的分子机制的研究，将启发我们思考LINE-1逆转座子这类“自私的基因”与基因组之间精彩的博弈过程。

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