纳米颗粒|提高抗原递送效率和免疫原性

前言

疾病来源蛋白质、肽、核酸或多糖可以用作治疗性疫苗或抗体的相关抗原。然而有时尽管使用高剂量注射和多次免疫，任然无法获得预期免疫效力，结果可以归结为两个主要原因：抗原传递效率太低难以被APCs捕获，和免疫原性低以至于无法引起足够的免疫应答。因此，需要能够改善抗原传递和增强免疫原性的佐剂来获得足够的免疫应答。纳米颗粒与细胞组分的大小相似，可以通过多种有效方式将抗原递送到淋巴结和增强免疫原性。还可以促进APCs对抗原呈递，引发细胞和体液反应。本期小编将为大家介绍纳米颗粒平台的作用，纳米颗粒类型、以及和抗原的作用方式。

纳米颗粒平台

生物制品中的纳米颗粒定义是粒径在1nm-100nm，或小于1000nm时表现出与其尺寸相关的物理、化学、生物效应的物质。由于纳米颗粒与细胞组分的大小相似，因此可以通过胞吞作用，进入活细胞。纳米颗粒平台是将抗原附着在有机或无机颗粒表面上（图1），通过增强细胞受体的识别和运输来促进免疫反应。

图1. 纳米颗粒的尺寸范围[1]

常用的纳米颗粒主要包括聚合物纳米颗粒（天然多糖和合成聚合物）、脂质纳米载体、蛋白质复合物、细胞穿透肽纳米载体、基于外泌体的递送系统、金属有机骨架（MOF）复合物以及无机纳米颗粒（二氧化硅、金、磁性骨架和碳骨架）。

纳米颗粒的作用

纳米颗粒在疫苗/抗原免疫中发挥的三个角色：佐剂、递送载体和平台。佐剂可以增强免疫反应，递送载体可以帮助输送抗原，平台让抗原附着在颗粒表面上。下面是对每种作用的描述。作为递送系统，纳米颗粒可以将抗原传递到免疫系统的细胞中，即抗原和纳米颗粒共同被免疫细胞摄取，或者作为瞬时传递系统，即保护抗原并在目标位置释放抗原。对于纳米颗粒作为传递系统，通常需要抗原和纳米颗粒的结合。作为佐剂，非特异免疫增强剂，纳米颗粒会激活某些免疫途径，从而可能增强抗原处理并提高免疫原性。

图2. 纳米颗粒在免疫过程中的三种作用：佐剂、递送载体和平台[2]

灰色圆圈代表纳米颗粒，绿色单元表示抗原。缩写PLA、PLGA和PEG分别对应聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙二醇。

用于抗原免疫的纳米颗粒类型

聚合物纳米颗粒 Polymeric nanoparticles

聚合物分为天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物包括壳聚糖、细胞糊精、海藻酸钠、右旋糖酐及其衍生物等多糖，可广泛用于蛋白质的胞内递送。合成聚合物种类繁多，包括PLG、PLGA、g-PGA、PEG和聚苯乙烯。PLG和PLGA具有优异的生物相容性和生物可降解性，是研究最广泛的聚合物纳米颗粒。g-PGA纳米颗粒由两亲性多肽组成，可以自组装成具有亲水性外壳和疏水性内核，常用于包裹疏水性抗原。PLA、PLGA、PEG和天然聚合物（如多糖）也被用于合成纳米凝胶颗粒，具有灵活的网孔尺寸、多价结合表面积大、水含量高和抗原载量高等有利特性。

无机纳米颗粒 Inorganic nanoparticles

许多无机纳米颗粒已经被研究用于疫苗佐剂和递送载体。虽然这些纳米颗粒大多数是不可生物降解的，但它们的优势在于其尺寸调节和表面修饰均易于实现，蛋白质可通过共价或非共价作用被稳定地与之连接。通常这些纳米颗粒通过内吞或膜融合机制内化入胞。

金属纳米颗粒主要包括金纳米颗粒（AuNPs）、磁性纳米颗粒（MNPs）以及金属有机骨架纳米颗粒（MOFs）， 具有尺寸小、形态稳定，易于制成不同的形状 (球形、棒形、立方体等) 的优点，尺寸范围为2-150 nm，并且表面修饰后可与抗原共价结合 。

碳纳米颗粒是另一种常见的疫苗佐剂和药物递送组分，具有良好的生物相容性，根据结构的不同，碳基纳米颗粒可大致分为碳纳米管（CNTs）、纳米金刚石（NDs）、碳纳米球（CNs）这几种类型。碳纳米管的直径通常为0.8-2nm，长度为100-1000nm，而碳纳米球的尺寸约为500nm。蛋白质和肽抗原可以共价结合到碳纳米颗粒用于免疫，并增强IgG反应水平。

二氧化硅纳米颗粒 (SiNPs)。通过利用溶胶-凝胶化学原理结合不同的结构导向剂，可制备具有不同结构和形态的硅纳米颗粒（SiNPs），主要包括介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）、树枝状二氧化硅纳米颗粒、空心二氧化硅纳米颗粒（HSNs）和固体二氧化硅纳米颗粒。SiNPs具有生物相容性，可用于各种应用，如选择性肿瘤靶向，实时多模成像和疫苗佐剂。

脂质体Liposomes

脂质体是由天然产物中的非免疫原性、无毒性和可生物降解的磷脂构成的类脂质小球体，根据脂质体粒径的大小和脂质双层膜数量，可以将脂质体分为单室脂质体（ULV）；寡层脂质体（100-1000nm）；多层脂质体（＞500nm）；多囊脂质体（＞1000nm）。脂质体的优势是多功能性和可塑性。利用其化学性质，水溶性抗原被包埋在脂质体的水性内部空间中，而亲脂化合物被嵌入到脂质双层中，同时抗原或其他佐剂可以通过吸附或稳定的化学连接附着到脂质体表面。脂质体是DNA疫苗研究中一种常用的载体系统，DNA被包裹在其中，可以更有效地穿过细胞膜到细胞内进行表达，脂质体在这个过程中起到保护和缓释作用。脂质体也可以被免疫刺激分子和靶向分子进行修饰，作为一种多功能疫苗佐剂传递系统参与免疫过程，它们能靶向免疫细胞甚至细胞器，产生溶酶体逃逸，促进抗体的交叉表达，从而极大地提高抗原的免疫效果。

病毒样纳米颗粒  

类病毒颗粒（VLPs）由病毒包膜或衣壳蛋白自组装形成，直径从20nm到800nm不等（图3），不含任何传染性成分。VLPs利用病毒结构的优势来增强免疫反应，即使在缺乏佐剂的情况下也能诱导强烈的免疫反应。由于相对易于设计，利用高稳定性和自组装性，VLPs是第一个用于疫苗的纳米颗粒。作为平台，VLPs已在临床试验和商业批准疫苗中广泛使用，证明了蛋白质平台技术的可靠原理。世界上第一个获得许可和批准的疟疾疫苗RTS,S就基于VLPs设计的。VLPs作为抗原平台已经显示出增强体液免疫反应的显著效果。然而，VLPs也存在局限性：

（1）表达产量低和存在宿主细胞杂质。在体内组装的VLPs可能会包含宿主DNA和其他宿主蛋白质，，去除此类杂质涉及复杂的纯化或体外解离和重组步骤。

（2）由于缺乏病毒基因组VLPs也存在稳定性问题。

（3）需要真核宿主表达系统才能获得其脂质膜。尽管VLPs已经得到了很好的证明，但制备复杂性限制了它作为平台的应用。

非病毒样的自组装纳米颗粒

许多高度寡聚的自组装蛋白质已成功用于非病毒样颗粒平台。自聚蛋白的一个特点是单个蛋白组分容易组装成稳定的高度寡聚体结构，非病毒蛋白聚合物可作为VLP的替代方案用于构建纳米颗粒平台。这些聚合物平台通常是酶或稳态蛋白，易于生产。然而，大多数自组装蛋白比VLP要小，并且只有一个可用于抗原附着的末端，因此有可能限制抗原的价数和兼容性。

图3. 不同自组装蛋白质的结构比较[2]

尺寸是从最长轴测量的。Subunits表示纳米颗粒内的单体数量。

免疫刺激复合物（ISCOM）

ISCOM是瑞典科学家Morein等在20世纪80年代研发的一类作为抗原递送的佐剂，将抗原和糖苷QuilA及胆固醇按一定比例混合后自发形成的具有较高免疫活性的笼状脂质小泡，可通过表面疏水作用捕获蛋白抗原，通过内吞作用被APC摄取。其具有递呈抗原和免疫佐剂的双重作用，所以其可刺激机体产生强烈、持久的“全面”免疫应答反应，主要用于增强亚单位疫苗的免疫原性。目前，兽用ISCOM疫苗已在国外投放市场。

乳剂Emulsions

纳米乳液（nanoemulsion）又称微乳液（microemulsion），是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成，粒径为1～100nm的热力学稳定、各向同性，透明或半透明的均相分散体系。纳米乳分为三种类型，水包油型纳米乳(O/W)、油包水型纳米乳(W/O)以及双连续型纳米乳(B.C)。纳米乳具有许多其它制剂无可比拟的优点：

①为各向同性的透明液体，属热力学稳定系统，经热压灭菌或离心也不能使之分层；

②工艺简单，制备过程不需特殊设备，可自发形成，纳米乳粒径一般为1～100nm；

③黏度低，可减少注射时的疼痛；

④具有缓释和靶向作用；

⑤提高药物/抗原的溶解度，减少在体内的酶解，提高药物的生物利用度。

图4. 图表总结列出在疫苗研究领域常用的纳米颗粒佐剂及其优缺点[3]。

纳米颗粒和抗原的作用方式

纳米颗粒和抗原的相互作用方式可以通过附着（如共价结合、包封或吸附）或简单混合来实现。硬材料纳米颗粒，如基于二氧化硅、金和磷酸钙，主要用作抗原附着的传递系统。附着抗原的方法可以通过基于电荷或疏水相互作用物理吸附或复杂化学偶联或包裹来实现。软物质纳米颗粒，如基于VLP、ISCOM、ISCOMATRIXTM或脂质体，主要通过化学共轭、吸附、封装或基因水平的融合实现抗原的附着。

物理吸附方法的纳米颗粒与抗原之间的相互作用相对较弱，可能会导致抗原和纳米颗粒在体内迅速解离。化学偶联或包裹提供更强的相互作用。抗原包裹是抗原在合成过程中与纳米颗粒前体混合，当前体分散成纳米颗粒时，抗原被封装在内。仅当纳米颗粒在体内或细胞内被分解时，抗原才会被释放。对于化学偶联，抗原是通过化学交联到纳米颗粒的表面。抗原与纳米颗粒一起被细胞吞噬，并在细胞内释放。

图5 纳米颗粒与抗原的相互作用方式示意图[1]。

小结

纳米技术在免疫学特别是疫苗研究领域的应用在过去十年中呈指数级增长并诞生了“纳米疫苗学”。在疾病预防和治疗中，纳米颗粒可被用作佐剂和递送系统以增强抗原处理和激活免疫反应。本期内容包含纳米颗粒背景相关的平台作用和常见纳米颗粒的介绍，下一期内容将为大家描述纳米颗粒在分子水平上是如何影响免疫应答和平台设计的考量因素。

参考资料：

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