科研丨华农＆广中医二附院: 植物甾醇通过调节小鼠肠道菌群和胆固醇代谢缓解高脂血症(国人佳作)

编译：微科盟Sky蓝

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

植物甾醇(PS)已被证明可以调节胆固醇代谢，缓解高脂血症(HLP)，但其机制尚不清楚。本文研究了PS调节高脂饮食(HFD)小鼠胆固醇代谢的机制。结果表明，PS处理降低了HFD小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的积累，同时提高了血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。与HFD小鼠相比，PS不仅提高了肝脏的抗氧化活性，还调节了胆固醇代谢相关酶和受体的mRNA表达水平。抗生素(Abx)干预消除了PS的降血脂作用，粪菌移植(FMT)干预恢复了PS的降血脂作用。16S rRNA测序分析结果表明，PS可调节小鼠肠道菌群。PS降低了HFD小鼠肠道中乳杆菌(Lactobacillus)和其他产胆盐水解酶(BSH-)的微生物群的相对丰度，这些菌群可能与胆固醇代谢有关。这些结果部分解释了PS调节胆固醇代谢的机制。这意味着调节肠道菌群将是治疗HLP的潜在靶点。  

图文摘要      

论文ID

原名：Phytosterols Alleviate Hyperlipidemia by Regulating Gut Microbiota and Cholesterol Metabolism in Mice

译名：植物甾醇通过调节小鼠肠道菌群和胆固醇代谢缓解高脂血症

期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity

IF：7.31

发表时间：2023.4

通讯作者：郭世宁，孙景波，毛炜

通讯作者单位：华南农业大学兽医学院；广州中医药大学第二附属医院

DOI号：10.1155/2023/6409385

实验设计

结果

1PS减轻HFD诱导的小鼠脂肪堆积

根据动物实验方案的实验设计，每周监测各组小鼠体重(图1 (b))。与HFD小鼠相比，HFD+PS小鼠在PS治疗8周后体重显著降低(图1 (c))。而HFD小鼠和HFD+PS小鼠的摄食量相似(图1 (d))。此外，我们测量了肝脏、肾周脂肪和附睾脂肪的重量，并观察了肝脏中脂质堆积和炎症变化的组织病理学变化。结果显示，与ND小鼠相比，HFD小鼠肝脏(图1(e))、肾周脂肪(图1 (f))和附睾脂肪(图1 (g))的脏器体重比显著增加，而与HFD小鼠相比，HFD+PS小鼠的脏器体重比显著降低。肝脏油红O染色和H&E染色切片结果显示，PS减轻了HFD小鼠肝脏脂肪变性和炎症变化(图2(a))。附睾脂肪H&E染色切片显示，PS降低了HFD小鼠的脂肪细胞面积(图2(a))。总之，PS干预降低了HFD诱导的小鼠脂肪堆积。

图1. PS减轻了HFD诱导的小鼠脂肪堆积。

(a) PS的化学结构。(b)实验设计。ND、HFD和HFD+PS小鼠的体重(c)和摄食量(d) (每组n = 6)。(e-g)各组小鼠肝脏、肾周脂肪、附睾脂肪的体重比(每组n = 5)。数据以均值±SD表示。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

2PS改善小鼠糖脂代谢紊乱

接下来，为了确定PS是否改善糖脂代谢，作者测定了小鼠血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C的浓度，这些被认为是严重高脂血症(HLP)的临床生物标志物。HFD小鼠TG、TC、LDL-C浓度显著升高，HDL-C浓度降低。与预期一致，PS处理后TG、TC和LDL-C浓度显著降低，HDL-C浓度升高(图2(b)-2(e))。为了探究PS是否调节小鼠的糖耐量，我们在口服葡萄糖3 h的过程中，每隔30 min测量一次血糖浓度。血糖谱和OGTT曲线下面积(AUC)显示，HFD小鼠葡萄糖AUC增加，糖耐量受损，而HFD+PS小鼠的糖耐量较HFD小鼠明显改善(图2 (f)和2 (g)。

图2. PS改善小鼠糖脂代谢紊乱。

(a)各组肝组织切片代表性H&E染色。比例尺：200  μm。(b-e)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C浓度(每组n = 5)。(f, g) ND、HFD、HFD+PS小鼠禁食12 h后给予2.0  g/kg葡萄糖的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果及3组小鼠曲线下面积(AUC)分析(每组n = 4)。数据以均值±SD表示。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

3PS提高HFD小鼠肝脏抗氧化活性

接下来，作者检测了肝脏中氧化应激相关指标的mRNA水平。与ND小鼠相比，HFD显著降低血红素加氧酶1 (HO-1)的mRNA水平；与HFD组小鼠相比，PS显著提高了Kelch样ECH关联蛋白1 (Keap1)、核因子E2相关因子2 (Nrf2)、HO-1、NAD(P)H醌脱氢酶1 (NQO1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA水平(图3 (a)~3 (f))。这些结果表明，PS不仅不会引起肝细胞损伤，而且显著提高了对HFD诱导的氧化应激的抵抗能力。

这些结果表明，HFD显著增加了小鼠血清TG、TC和LDL-C的浓度，降低了HDL-C，导致HLP，并导致糖耐量受损。PS治疗逆转了这些变化，改善了HLP和葡萄糖耐量。

图3. PS提高了HFD小鼠肝脏抗氧化活性。

 (a~f)肝脏抗氧化基因Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM、GCLC的mRNA相对表达量(每组n = 3)。 数据以均值±SD表示。 与ND组相比， # P < 0.05， ## P < 0.01和 ### P < 0.001； 与HFD组相比， * P < 0.05， ** P < 0.01和 *** P < 0.001。

4PS调节胆固醇代谢相关酶和受体的mRNA表达

为了探讨PS改善HLP的作用机制，我们首先检测了胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、固醇12α羟化酶(CYP8B1)、氧固醇7α-羟化酶(CYP7B1)和甾醇27羟化酶(CYP27A1)以及与胆固醇代谢相关的胆汁酸(BA)合成限速酶的mRNA水平。结果显示，与ND小鼠相比，HFD小鼠CYP7A1和CYP8B1的表达明显升高，CYP27A1和CYP7B1的表达也呈增加趋势。PS干预导致HFD小鼠CYP8B1的mRNA相对表达量显著降低，CYP7A1呈下降趋势。在HFD+PS小鼠中，CYP7B1显著上调，CYP27A1有升高的趋势(图4 (a)-4 (d))。 接下来，本研究还分析了肝脏中胆固醇代谢相关受体的mRNA相对表达量。结果显示，HFD引起小鼠成纤维细胞生长因子受体4 (FGFR4)、Takeda G蛋白偶联受体5 (TGR5)、法尼醇X受体(FXR) mRNA相对表达量升高，小异源二聚体蛋白(SHP) mRNA相对表达量降低。在HFD小鼠中，PS处理导致肝脏中TGR5和FGFR4的mRNA相对表达量显著降低，FXR和SHP的mRNA水平显著升高(图4(e)-4(h))。

如上所述，PS抑制了肝脏胆固醇代谢的经典途径，促进了替代途径限速酶的表达。同时，PS抑制TGR5和FGFR4受体的表达，促进FXR和SHP受体的表达。

图4. PS调节胆固醇代谢相关酶和受体的mRNA表达。

(a~d)肝脏中CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、CYP7B1等CYPs mRNA相对表达量。(e-h)肝脏中FGFR4、TGR5、SHP、FXR mRNA相对表达量。数据以均值±SD表示(每组n = 3)。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。

5PS缓解HLP的作用依赖于肠道菌群

既往研究表明，肠道菌群及其代谢产物与胆固醇代谢密切相关。为了验证PS的降血脂作用是否与肠道菌群有关，我们用Abx和FMT处理小鼠。结果显示，与HFD+non-Abx+PS小鼠相比，HFD+Abx+PS小鼠的TG、TC、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低(图5 (a)-5 (d))。这意味着PS的降血脂作用被消除。此外，我们用PS处理FMT供体小鼠，并对Abx预处理的HFD小鼠给予FMT。与HFD+NS小鼠相比，HFD+FMT小鼠的TG、TC、LDL-C显著降低，HDL-C显著升高(图5 (e)-5 (h))，HLP明显改善。综上所述，PS缓解HLP的作用与肠道菌群密切相关

图5. PS缓解HLP的作用依赖于肠道菌群。

(a) HFD+Abx+PS和HFD+non-Abx+PS小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的浓度。(e-h) HFD+NS和HFD+FMT小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的浓度。数据以均值±SD表示(每组n = 5)。*P < 0.05和**P < 0.01。

6PS改变小鼠肠道菌群结构

首先，肠道菌群的主成分分析(PCA)结果显示，ND组、HFD组和HFD+PS组的肠道微生物物种丰度存在不同的聚类(图6 (a))。此外，层次聚类分析显示PS处理改变了HFD小鼠的肠道菌群(图6 (b))。属水平的微生物群落组成分析显示，与HFD小鼠相比，HFD+PS小鼠Allobaculum的相对丰度降低(图6 (c))，乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)呈降低趋势(图6 (d)-6 (g))。值得注意的是，在种水平上，PS处理导致HFD小鼠阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)显著减少(图6 (h))。Pearson相关系数表明，总体而言，这些产生胆盐水解酶(BSH-)的肠道微生物群的相对丰度与TG、TC、LDL-C和HDL-C的浓度以及细胞色素P450s (CYPs)的表达显著相关(图6 (i))。这些结果表明，PS的降血脂作用与改善小鼠肠道菌群结构有关。

图6. PS改变了小鼠肠道菌群结构。

(a)主成分分析(PCA)图。(b)层次聚类分析。(c-g)肠道菌群在属水平上的相对丰度，包括Allobaculum、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus) (每组n = 4)。(h)阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)的相对丰度。(i)肠道菌群与TC、TG、LDL-C、HDL-C、CYPs之间的Pearson相关系数。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。    

讨论

HLP是一种常见且普遍的疾病，发生在肥胖或超重人群中，通常与糖尿病、高血压和冠心病并发。HLP的病因因人而异，膳食脂肪过多、肥胖、长期大量饮酒是其常见原因。在世界范围内，HLP的患病率和发病率呈快速增长趋势。研究表明，男性和女性不仅在雌激素方面存在显著的生理差异，而且在参与胆固醇稳态的蛋白质方面也存在显著的生理差异，这就解释了为什么绝经前女性能够更好地维持胆固醇稳态和抵抗HLP。男性更易患HLP，这也是我们选择雄性小鼠作为实验动物的原因。他汀类药物是靶向治疗HLP的有效药物，可显著降低TC水平，以及降低TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平。但其主要有转氨酶升高、肌病等副作用，包括肌痛、肌炎、横纹肌溶解等，易导致预后不良。PS因其在自然界中的广泛存在及其强大的性能而被广泛应用于医学研究。多项研究表明，PS显著降低血胆固醇浓度，在肥胖、HLP和糖尿病的治疗中具有重要的临床价值。在本研究中，PS治疗缓解了HFD小鼠的HLP，血清TG、TC和LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著升高。这些变化与已报道的PS降血脂作用一致。此外，我们还检测了PS对肝脏抗氧化功能的影响。在我们的实验中，PS提高了HFD小鼠Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM和GCLC的mRNA相对表达量。

本研究表明，PS处理不仅没有引起HFD小鼠肝脏损伤，而且增强了肝脏的抗氧化作用。 作者推测PS的降血脂作用与肝脏胆固醇代谢途径有关。BA代谢是胆固醇排泄的重要途径。机体内约1/3的胆固醇分解代谢是通过BA合成实现的。BA的肠肝循环在营养吸收、分布、代谢调节和体内平衡中起着核心作用。BAs是由肝脏中一系列CYPs通过经典途径和替代途径两种生物合成途径催化胆固醇的氧化产生的。在经典途径中，CYP7A1限速酶介导胆酸(CA)的产生，CYP8B1-/-小鼠不能产生CA，CYP7A1表达增加，BA池扩大。在替代途径中，CYP27A1限速酶介导27-羟基胆固醇的催化形成，然后由CYP7B1进一步催化生成鹅脱氧胆酸(CDCA)。CD和CDCA均为肝细胞以胆固醇为原料直接合成的初级胆汁酸。产生的初级BA再与牛磺酸和甘氨酸结合形成结合型BA，通过胆盐输出泵主动转运到胆汁中，储存在胆囊中，随后释放到十二指肠发挥功能。在我们的实验中，PS干预下调了HFD小鼠BA合成经典途径中的CYP7A1和CYP8B1酶，而BA合成替代途径中的CYP27A1和CYP7B1酶上调。

作者推测PS通过调节这些限速酶的表达来改善胆固醇代谢。 根据先前的报道，肝脏中FXR和FGFR4受体的信号可以控制肝脏中BA的合成途径，而BA在肠肝循环中的转运改变了BA池的组成、大小和分布，进而对BA信号传导及其下游代谢靶点产生重要影响。FXR仅被BA激活，在肠道中，FXR的激活促进FGF15的释放和对靶组织受体的信号传导。研究发现，FGF15-FGFR4信号的上调加速了非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)向肝细胞癌(HCC)的进展。

在本研究中，PS降低了肝脏FGFR4的表达。据报道，抑制FGFR4信号可以改善肝脏代谢，是治疗NAFLD和HCC的一个有前景的选择。调节肝脏FXR-SHP通路可以调节胆固醇转化和脂肪酸代谢，从而减少肝脏脂质的积累。FXR通过诱导SHP抑制CYP7A1负反馈调节胆汁酸合成。PS干预激活了肝脏中的FXR-SHP通路，该通路被认为是抑制BA合成的经典途径，并激活了替代途径。此外，有证据表明FXR导致肠道脂肪吸收发生显著变化，并选择性地减少脂肪生成。因此，FXR-SHP通路可能成为调节BA和脂质代谢治疗HFD诱导的HLP的一种可行的治疗方法。TGR5是一种特异性细胞表面受体，可直接响应BA，并通过控制胆汁疏水性和细胞因子分泌来保护肝脏免受BA超负荷的影响。TGR5调节BA、脂质和碳水化合物代谢、能量消耗和炎症相关基因的表达和活性。作者认为，PS的降胆固醇作用是通过降低肝脏TGR5和FGFR4受体的表达，增加肝脏FXR和SHP受体的表达来介导的，从而抑制BA合成的经典途径，促进了替代途径。这些结果部分解释了PS调节BA代谢的分子机制，并表明调节BA合成的替代和经典途径可能是治疗HLP的潜在靶点。PS的干预通过激活或抑制受体来调节CYPs的表达，最终影响胆固醇代谢。

如上所述，BA的合成是胆固醇代谢的一个重要途径。肝-肠轴信号直接调节肠道菌群与BA代谢的关系。在肠道中，肠道菌群结构与BA的微生物代谢存在相互作用，微生物代谢可形成BA的疏水池，增强BA的清除。胆盐水解酶(BSH-)水解结合型胆汁酸，这些反应主要发生在远端小肠和近端结肠，与产生BSH-的细菌种群有关。据报道，BSH-活性主要来源于乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)，其中乳杆菌中的BSH-T3酶活性最高。相反，降低乳杆菌的相对丰度会降低BSH-活性，导致BA的组成发生变化，最终缓解肥胖。先前的研究表明，通过调节肠道菌群和BA代谢可以改善HFD小鼠的脂质代谢。本研究发现，对小鼠进行抗生素(Abx)处理后，PS的降血脂作用被消除了。然而，FMT后，HFD小鼠具有抵抗HLP的能力。因此，我们推测PS的降血脂作用与肠道菌群有关。相关性分析表明乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)的相对丰度与高脂血症密切相关。

此外，这些菌属与CYP7A1和CYP8B1的表达呈正相关，而芽孢杆菌属与CYP7B1呈负相关。本研究对肠道菌群的分析表明，PS降低了HFD小鼠中乳杆菌和其他产BSH-的肠道菌群的相对丰度，这可能对调节BA代谢至关重要。有趣的是，PS处理显著降低了阴道乳杆菌的相对丰度。此外，Allobaculum与HLP呈正相关，PS干预导致HFD小鼠Allobaculum显著减少。 在以往的研究中，PS抑制胆固醇吸收的机制主要集中在竞争结合位点、减少胆固醇吸收、干扰BA代谢机制等方面。一些研究认为，PS不被机体吸收，但其与胆固醇的结构相似性使其可以抑制胆固醇吸收，包括循环内源性胆汁胆固醇。换言之，PS可能通过直接影响肠道菌群结构或通过间接抑制胆固醇吸收影响BA代谢。一种假说认为，PS直接调节肠道菌群的结构，从而影响BSH的活性，减少结合型BA的水解，进而减少BA的合成。另一种假说是，PS通过与胆固醇竞争减少胆固醇吸收，从而降低HFD小鼠肝脏胆固醇代谢和BA合成。这两种假设都需要通过更深入的实验来验证。应该在动物模型和人体中开展更多设计良好的研究，以测试其安全性和有效性。然而，无论PS的作用是直接的还是间接的，本研究都说明了PS在缓解HLP方面的临床相关性。  

结论

综上所述，本研究发现PS显著提高了小鼠肝脏的抗氧化功能，缓解了HLP。其机制与调节胆固醇代谢和肠道菌群结构有关。PS处理可调节肠道菌群的相对丰度，激活SHP和FXR，抑制FGFR4和TGR5，抑制BA合成的经典途径(CYP7A1和CYP8B1)，激活BA合成的替代途径(CYP27A1和CYP7B1)。本研究结果部分解释了PS治疗HLP的机制，可能与调节胆固醇代谢途径和肠道菌群结构有关。