细胞特异性mRNA递送的LNP文库筛选

导读

脂质纳米颗粒（LNPs）是用于RNA治疗和疫苗领域备受关注的非病毒药物递送系统。然而，低效的肝外细胞类型特异性mRNA递送阻碍了新型RNA疗法的发展。本文通过不同的疏水尾链与连接子组合设计，合成了一种新型的可电离脂质库，利用微流控与其他辅助脂质混合，形成稳定的LNP。使用Luciferase-mRNA、mCherry-mRNA、Cre-mRNA及TdTomato动物模型，鉴定出不同细胞类型特异性的LNP用于递送mRNA。

可电离脂质的结构设计

这里主要目的是设计和合成新的氨基可电离脂质，以安全的方式增强体内mRNA的递送。在之前的研究中发现与肼连接子相比，羟胺（脂质6）和乙醇胺（脂质8）连接子显示出良好的RNA递送功效[A Combinatorial Library of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery to Leukocytes]。因此，这里将在脂质6和脂质8连接子基础上，用其他疏水尾部取代其中的亚麻酰疏水尾部。其中脂质16和17用非支链酯作为一条疏水链，脂质18和19使用支链酯尾替换其中一条疏水链，非支链和支链酯尾的组合生成脂质20和21，而两个不同的支链酯尾用于脂质22和23（图1）。

图1 氨基可电离脂质的结构

结果增强mRNA递送的LNPs体外筛选

使用微流体混合装置制备基于脂质的电离LNP（图2a），包封萤火虫荧光素酶mRNA（mLuc）的所有LNP具有均匀的粒径分布，在40至80 nm之间，Zeta电位在−7至2 mV之间，LNP在其物理化学特性上具有相似性（图2b），且这些LNP制剂的包封率都>70%（图2c）。基于DLS分析的稳定性研究中，在2–8°C条件下储存一个月后，size、PDI和包封率变化差异不大。用脂质16和17制备的LNP的储存稳定性略低于其他LNP（图2d–f）。用上述LNP分别转染B16F10、CT26和Raw264.7以评估了这些不同LNP的mRNA递送效率，这3种细胞系分别代表上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，体外萤光素酶检测结果显示，脂质16和脂质22的mRNA递送效率较低，其中脂质22的mRNA递送最低（图2g）。羟胺连接子可电离脂质的mRNA递送效率比乙醇胺连接子更低，尤其是结构中有支链酯链的脂质18和22。具有支链酯尾的一对脂质在mRNA递送方面具有显著差异（图2h）。这些结果表明，将羟胺接头与支链酯尾结合会降低mRNA递送，在体内筛选实验中排除脂质18和22。

图2 用于mRNA递送的氨基可电离LNPs的体外筛选

用于mRNA递送的LNPs的体内筛选

为了在体内筛选剩余的8种可电离脂质，在C57BL/6小鼠中静脉注射0.5 mg/ kg 的mRNA-LNP，并在器官和细胞水平上分析mRNA的表达（图3a）。在这些mRNA-LNP注射6小时后，在肝脏和脾脏中检测到大部分萤光素酶信号，对照脂质8在器官中的表达最低，脂质6相比，两种脂质显示出显著差异（图3b，c）；与脂质6-LNP相比，脂质16-LNP在肺（4.18倍）和脾脏（4.56倍）中的表达更高；脂质20-LNP脾脏的mRNA递送略高于脂质6-LNP（图3c-e）。脂质23-LNP在肝脏中的mRNA递送最高，是脂质6-LNP的2.03倍（图3c–e）。在体外实验中脂质17-LNP与脂质16-LNP的表达相当，但在体内脂质17-LNP的表达是最低的，从24h实验组中排除。脾与肝的Luc信号强度比率表明脂质8和脂质16-LNP的值最高，而脂质23-LNP组的最低值。

图3 用于mRNA递送的氨基可电离LNPs的体内筛选

随后注射mCherry mRNA-LNP，并在细胞水平上分析表达，研究LNP的不同细胞类型分布情况。选择体内Luciferase高表达的脂质6、16、20和23，用于细胞分布研究。mCherry mRNA-LNP粒径50至80nm区间内，这与mLuc LNP一致。根据CD45、CD11b、Gr1、F4/80、CD3、CD19和CD31的表达对细胞进行圈门，脂质6-LNPs在肝脏中内皮细胞（11.85%）和肝细胞（4.57%）中mCherry都有表达，但在其他类型的细胞和器官中未见显著表达。脂质23-LNP在肝细胞（6.61%）和CD11b巨噬细胞（1.72%）中的mCherry表达高于其他细胞。而与脂质6和23 LNP相比，脂质16-LNP在所有器官的巨噬细胞中显示出最高的mCherry表达（肺、肝和脾中mCherryCD11b巨噬细胞分别为6.38%、5.84%和7.04%），而肝细胞和肝内皮细胞中mCherry的表达略低（图3f–h）。在脾脏和肝脏中观察到mCherry表达率和mLuc表达率之间高度相关（图3i）。然而，LNP的大小或电荷与脾脏mRNA递送没有显示出显著的相关性，这与先前有研究中带负电荷的LNP用于脾脏mRNA递送不同。LNP的较低pKa值是增加脾脏mRNA递送的一个因素，TNS测定的结果表明，mRNA-LNPs的pKa值与脾脏mRNA表达水平之间的相关性较低（图4）。

图4  LNPs的pKa值和脾脏mLuc表达的相关性

LNPs体内选择性肿瘤靶向mRNA递送

尽管mLuc和mCherry mRNA的递送研究代表了LNP递送的mRNA的时间表达，但很难分析对mRNA表达的累积影响。因此，在tdTomato-Cre重组酶小鼠模型中研究了mRNA表达的累积效应。脂质16与23-LNP包封Cre重组酶mRNA，静脉注射后72小时，在器官中分析Cre重组酶诱导的tdTomato表达（图5a），两种LNP在肝内皮细胞和肝细胞中都表现出最高的tdTomato表达，表达水平约为40%，脂质16和脂质23在肝细胞表达方面略有差异。在所有器官的CD11b巨噬细胞群中观察到脂质16和脂23在tdTomato表达方面的显著差异，这些结果与mCherry mRNA递送数据一致（图5b）。

图5 Cre-mRNA的体内递送及肿瘤靶向mRNA递送研究

接下来在B16F10黑色素瘤模型中研究脂质是否具有肿瘤内特异性递送作用。与脂质6-和脂质23-LNP相比，脂质16-LNP对肿瘤组织的mLuc递送更高，萤光素酶信号强度增加了3.79倍和2.48倍（图4d）。荧光素酶强度的肿瘤与肝脏比率表明脂质16-LNP的最高值（图4e）。这些结果表明脂质16-LNP具有肿瘤靶向治疗性mRNA递送的潜力，例如分泌性免疫检查点阻断抗体和抗肿瘤细胞因子。

mRNA-LNPs的体内毒性研究

最后，通过测量肝脏内酶的表达水平和器官组织学来评估mRNA-LNPs的体内毒性。在mRNA剂量为0.5 mg/kg时，与对照组相比，所有LNP治疗组的肝酶水平和血液标志物（如肌酸酐、胆红素和总蛋白水平）均未观察到显著差异（图6a），注射mRNA-LNP后24小时，H&E染色图像显示肝脏和脾脏没有毒性迹象（图6b）。

图6  mRNA-LNP体内毒性研究数据

与SM-102 LNP体内mRNA递送的比较研究

SM-102是一种用于开发新冠肺炎mRNA疫苗的可电离脂质，已被批准用于mRNA递送。脂质23-LNP在肝脏中与SM-102-LNP的mRNA递送效率相当，而脂质16-LNP与SM-102 LNP相比，脾脏的mRNA递送效率更高，但向肺部的mRNA递送更低（图7a）。LNP（脂质16、脂质23）的全身mRNA递送效率与SM-102 LNP相当，但对每个器官都显示出更高的特异性（图7b）。

图7  mRNA-LNP与SM-102 LNP体内mRNA递送的比较

讨论

在此，合成了一种新的氨基可电离脂质库，并筛选出了体内有效选择性递送mRNA的最佳脂质。结果表明，当与羟胺连接子结合时，具有支链酯尾链的脂质mRNA递送效率较低，当与乙醇胺连接子结合时，具有支链酯尾链的脂质mRNA递送效率较高，且这种递送会显现出针对器官和细胞的偏好性。例如这里在体外和体内筛选确定的巨噬细胞细胞类型特异性脂质 16和用于肝脏靶向的脂质23（图6c）。基于这种氨基可电离脂质的LNPs的内在细胞类型特异性递送为未来开发有效的mRNA疗法开辟了新的途径。

参考文献：

1. Naidu, G. S., Yong, S.-B., Ramishetti, S., Rampado, R., Sharma, P., Ezra, A., Goldsmith, M., Hazan-Halevy, I., Chatterjee, S., Aitha, A., Peer, D., A Combinatorial Library of Lipid Nanoparticles for Cell Type-Specific mRNA Delivery. Adv. Sci. 2023, 2301929.

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