快报 | MeltPro MTB/PZA在耐利福平结核病患者中检测吡嗪酰胺耐药性的应用

作者：李蓉，李杨，陈昕昶，贾立娜，于红缨，黄娅，仵倩红，肖明英，葛诗佳，张忆琳，冯珍，李庆阁，许晔，石文志，孙峰，张文宏

第一作者及单位：李蓉，复旦大学附属静安区中心医院；李杨，复旦大学附属华山医院；陈昕昶，复旦大学附属华山医院；贾立娜，贵阳市公共卫生救治中心；于红缨，怀化市第一人民医院

通信作者及单位：孙峰，复旦大学附属华山医院

Ability of the MeltPro MTB/PZA Assay to Detect Susceptibility to Pyrazinamide in Rifampin-Resistant Tuberculosis Patients

Microbiol Spectr. 2023，May 10:e0483622.

doi:10.1128/spectrum.04836-22.

研究背景

耐药结核病(DR-TB)仍然是一个严重的公共卫生问题。吡嗪酰胺(PZA)是一种烟酰胺类似物，在结核病治疗中发挥关键作用，通过杀死半休眠期的结核分枝杆菌(MTB)，将结核病的治疗期从9～12个月缩短至6个月。然而，在耐多药或耐利福平结核病(MDR/RR-TB)患者中PZA耐药为38%至60.5%。因此，对于MDR/RR-TB患者，检测PZA是否耐药是很重要的，且PZA耐药与治疗时间的延长和治疗转阴率相关。

目前，仍然缺乏PZA的快速检测分子手段，而表型药敏试验延迟了包括或替代PZA精准治疗的启动时间。此外，PZA的表型药敏检测是不可靠的，因为PZA活性需要严格的酸性条件，且大量接种易感菌株可能导致假阳性结果。二代测序(NGS)是一种很有前途的检测工具，诊断PZA耐药的敏感度为91.3%，特异度为96.8%。由于需要专业知识和仪器，可能只在资源丰富的地区进行。用于利福平快速检测的分子工具可以帮助临床医生定制治疗方案并做出决策，而临床环境中没有PZA的快速分子检测方法。

PZA分子检测基于编码吡嗪酰胺酶的pncA基因启动子和开放阅读框的突变检测。据报道，耐药相关的pncA突变分散在整个基因中，阻碍了基于探针检测或Sanger测序的快速直接检测方法的发展。以往的研究报道了少量从痰液中检测PZA耐药的新方法，但实际过程复杂且耗时，需要2d才能获得结果。

厦门致善生物科技有限公司开发的MeltPro MTB/PZA检测方法是一种检测PZA耐药的快速分子检测方法。可直接对痰标本进行检测，周转时间短，半自动化操作。该研究旨在评估该方法的诊断准确性。

一、材料和方法

1.研究流程：在2020年6月1日至2021年4月30日期间，基于三个已注册的临床研究(NCT03867136;NCT04717908;NCT05081401)。临床研究是通过快速分子检测确定的耐药结核病优化方案。该研究招募的患者在完成快速检测后能够提供足够的痰液样本。如果患者剩余的痰液量超过0.5ml，则可用MeltPro MTB/PZA进行检测。在临床研究中对所有患者进行基线痰培养，若痰培养阳性，将灭活菌株送NGS进行检测。

此外，所有不一致的结果均采用Sanger测序分析。若NGS测序结果与Sanger测序结果不一致，则以Sanger测序结果为金标准。若Sanger测序结果失败，则以NGS结果作为参考方法。在入组时记录人口统计信息、病史和胸部影像学结果。样本在知情同意下获得，并经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准。

2.MeltPro MTB/PZA检测技术：用LabAid-824S中包含的缓冲液溶解痰液后半小时内，通过自动DNA提取仪(LabAid-824S, 致善, 厦门, 中国)提取痰液DNA。然后按照说明书进行MeltPro MTB/PZA检测。该方法采用熔解曲线分析法是一个自动化的过程，在4个通道中有覆盖pncA突变(561 bp)和pncA启动子区域(位置-16~-1)，以确定PZA是否耐药。检测结果可报告为耐药、敏感或不确定等结果。

3. 全基因组测序：NGS作为本研究的金标准，对所有痰培养阳性的菌株进行基因型耐药检测。所有菌落均从培养基中刮取以保持菌株的多样性。采用总核酸提取法(IngeniGen XMK Biotechnologies)提取基因组DNA，采用IngeniGen DNA文库制备法(IngeniGen XMK Biotechnology)构建测序文库。在NovaSeq 6000系统上进行菌株的测序。

利用单核苷酸多态性(SNPs)检测次要亚群，保留所有突变频率超过10%的SNPs。由于NGS的局限性(即无法检测到大片段缺失)，MeltPro MTB/PZA检测和NGS结果不一致的菌株均进行Sanger测序作为最终结果。具有pncA非同义突变或移码突变的菌株经NGS检测结果为PZA耐药。

3.统计学处理：计算该方法检测PZA耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性。当检测结果被归类为"未检测到MTB "、"无效"或"不确定"时，只要有足够的痰液样本，即会重复检测。当第二次检测的结果仍不确定(未检测到MTB、无效或不确定)时，则列出该检测的结果。分类变量比较采用卡方检验，连续变量比较采用独立样本t检验。P＜0.05认为有统计学意义。所有统计检验均使用STATA软件进行。

研究结果

1. 研究人群：在2020年6月1日至2021年4月30日期间，共有239例RR-TB患者入组了临床研究并进行本研究初筛。在排除了19例没有足够痰液的患者后，剩余的220例患者均符合本研究的条件，并进行MeltPro MTB/PZA检测(图1)。参与者的人口统计学特征见表1。大多数患者(201/207,97.1%)痰涂片阳性，175例有肺部空洞。DNA测序发现207例患者中有66例(31.9%)为PZA耐药(图1)。

图1  入组患者的临床和人口学特征

2. MeltPro MTB/PZA检测性能：共有40例患者(18.2%，40/220)没有可解释的MeltPro MTB/PZA结果。其中， 在220例患者中有25例(11.4%)，MeltPro MTB/PZA不能提供判读PZA耐药信息，其中24例报告为“未检测到MTB”，1例结果无效。MeltPro MTB/PZA检测MTB的敏感度为88.2%(95%CI：83.9 ~ 92.4)。此外，15例(6.8%)患者MeltPro MTB/PZA检测结果为PZA耐药不明确。与MeltPro MTB/PZA检测结果可解释的患者相比，无可解释结果的患者出现肺部空洞的比例显著降低(90.0% 和 65.0%， P＜0.01）（表1)。该方法检测的中位时间为4小时(四分位数范围为3.5-4.5)，其中包括标本消化和去污，PCR程序和熔解曲线分析和报告。

表1 入组患者的临床和人口学特征

注  N：数量， MTB：结核分枝杆菌，PZA：吡嗪酰胺，SD：标准差，BMI：身体质量指数， TB：结核

3.MeltPro MTB/PZA法检测PZA耐药的性能：在180例有可解释的MeltPro MTB/PZA检测结果的患者中，有13例培养阴性或原始NGS测序数据不足。因此，167例患者被纳入主要分析。MeltPro MTB/PZA检测PZA耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为91.4% (95%CI：87.1～95.6)、89.9% (95%CI：85.3～94.5)、82.8% (95%CI：77.1～88.5)、95.2% (95%CI：91.9～98.4)和90.4% (95%CI：86.0～94.9)。在有肺部空洞的患者中，研究分析的诊断性能略有改善。MeltPro MTB/PZA检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为94.5% (95%CI：90.9~98.2)、94.7% (95%CI：91.1~98.3)、91.2% (95%CI：86.7~95.8)、96.7%(95%CI：93.9~99.6)和94.6% (95%CI：91.0~98.3)(表2)。

表2  MeltPro MTB/PZA法检测PZA耐药的性能

注 N：数量，TP：真阳性，FP：假阳性，FN：假阴性，TN：真阴性，CI,  PPV：阳性预测值， NPV：阴性预测值，PZA：吡嗪酰胺

4 .MeltPro MTB/PZA与NGS的不一致结果：该方法在58个经NGS测序确认的耐药 中正确检测出53个(91.4%)PZA耐药的情况。对NGS和MeltPro MTB/PZA检测结果不一致的分离株进行Sanger测序。MeltPro MTB/PZA检测中分别有5份和11份样品被误诊为敏感或耐药。

有7株菌株结果为MeltPro MTB/PZA敏感但NGS耐药，其中5株经Sanger测序证实具有与NGS检测相同的突变。Sanger测序确认敏感的另外2个分离株NO.336和R-019, NGS检测的pncA突变率分别为10%和29%，说明分离株存在异质性。

最初，共有14株NGS敏感菌株被MeltPro MTB/PZA误诊为耐药，其中7株经Sanger测序证实为pncA野生型。有4株结果为MeltPro MTB/PZA耐药和NGS敏感的菌株Sanger测序失败，仍以NGS为金标准。在Sanger测序证实的3株耐药菌株中，由于NGS技术的限制，遗漏了超过7bp的缺失或插入，NGS遗漏了P-083(196-206缺失)和No.143(399-408缺失)。在12例培养阴性和1例NGS分析原始数据不足未获得NGS结果的患者。经MeltPro MTB/PZA检测后，4例患者PZA耐药，9例患者PZA易感。

5 .MeltPro MTB/PZA不可解释的结果:第一轮检测结果为耐药不明确的18例，未检出MTB的 33例，无效1例。在19例剩余痰量充足的患者用MeltPro MTB/PZA检测法重新检测，其中13例结果可解释，其余仍不确定。当纳入耐药不明确的结果时，该方法的敏感度和特异度分别为85.5% (95%CI：76.7～94.3)和81.7% (95%CI：74.7～88.6)。

研究结论

PZA是治疗结核病最常用的短期方案的关键组成部分。因此，有必要对PZA的耐药性进行鉴定。在PZA耐药率较低的地区，MeltPro MTB/PZA检测可以作为理想的初级筛查工具。在耐药结核人群中，它可作为快速和初步确定PZA耐药性的附加检测，而NGS可用于后续验证。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社的观点

供稿：李  蓉

编辑：于   菲  

审校：范永德

发布日期：2023-06-09

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