快报 | 基于LNA探针的多重RAP方法快速检测结核分枝杆菌利福平耐药位点的研究

作者：张瑞卿，欧喜超，孙秀丽，凡国豪，赵冰，田丰雨，李逢钰，申辛欣，赵雁林，马学军

第一作者及单位：张瑞卿，中国疾控中心病毒病所；欧喜超，中国疾控中心结核病预防控制中心；孙秀丽，华北理工大学

通信作者及单位：马学军，中国疾控中心病毒病所；赵雁林，中国疾控中心结核病预防控制中心；申辛欣，中国疾控中心病毒病所

Multiplex LNA probe-based RAP assay for rapid and highly sensitive detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis

Ruiqing Zhang, Xichao Ou, Xiuli Sun, Guohao Fan, Bing Zhao, Fengyu Tian, Fengyu Li, Xinxin Shen, Yanlin Zhao, Xuejun Ma

Front Microbiol, 2023, 14:1141424.

doi: 10.3389/fmicb.2023.1141424

PMID: 37180280.

研究背景

世界卫生组织（WHO）2021年全球结核病报告指出，利福平耐药结核病（RR-TB）仍然是一个主要的公共卫生威胁。在耐药结核病高流行地区需要应用快速、可靠、价廉的技术和方法来发现RR-TB患者，但由于结核分枝杆菌（MTB）生长缓慢，传统基于培养的药物敏感性试验（简称“药敏实验”）至少需要4周才能识别耐药结核分枝杆菌。核酸扩增技术（NAAT）通过检测耐药相关基因是否发生突变或缺失，来判断相应抗结核药物的耐药性，已被逐步用于诊断RR-TB。在NAAT中，锁核酸（LNA）探针荧光PCR检测是最可靠的检测方法之一，LNA探针可以通过扩增曲线轻易地分辨出单碱基突变，而不需要根据探针间阈值循环数（Ct值）差异或进行额外熔解温度（Tm）分析来判读。但是，传统基于LNA探针的荧光PCR检测耗时长且灵敏度不高。

结合重组酶介导等温扩增（recombinase aided amplification, RAA）和qPCR技术优势开发的RAP（recombinase aided PCR）方法，可用于快速、高灵敏地检测呼吸道病毒。RAP方法的主要原理是用RAA技术预先反应10 min，富集目标DNA片段，随后qPCR可以通过较少的热循环次数扩增RAA富集后的模板，从而提高检测灵敏度且节省反应时间。本研究首次开发了一种基于LNA探针的多重RAP方法，即MLP-RAP，以检测RR-TB的多个点突变。该技术是基于石蜡的物理分离策略，在实现不开盖的情况下单管内先后进行RAA和qPCR反应，从上机开始可在60 min之内完成结核分枝杆菌利福平耐药位点的快速和高灵敏度检测。

材料和方法

一、引物、LNA探针设计与合成

本研究检测靶标基因为rpoB基因（AL123456.3；760647nt至761606nt），其突变主要发生在516密码子、526密码子、531密码子和533密码子上。采用两管（敏感管和耐药管）同时检测结核分枝杆菌利福平耐药突变基因，敏感管和耐药管的RAA引物（RAA-F和RAA-R）和PCR引物（PCR-F和PCR-R）相同，敏感管包含3条标记有不同荧光基团的LNA探针，3条探针完全匹配野生型模板，分别覆盖rpoB基因的3个不同位置（WT1-P覆盖密码子516，WT2-P覆盖密码子526，WT3-P覆盖密码子531和533）；耐药管包含4条标记有不同荧光基团的LNA探针，4条探针完全匹配4种突变类型模板，MUT1-P、MUT2A-P、MUT2B-P和MUT3-P分别与4种突变型rpoB基因序列（D516V、H526Y、H526D和S531L）严格匹配，如图１所示。

图1  MLP-RAP原理示意图

二、MLP-RAP方法体系配置及结果判读

每份样本提取的DNA模板均放入1个敏感孔和1个耐药孔中，结合两孔的扩增曲线判读结果。将敏感管和耐药管的qPCR体系分装入八联管后加入25 μl的正二十二烷，置于LongGene A300（60 ℃ 1 min，4 ℃ 30 s），使得正二十二烷均匀浮于qPCR体系之上。每个RAA（基础法）反应单元管加入40 μl RAA反应体系溶解干粉，将单元管在混匀仪中混匀两次。10 μl的RAA体系分装到凝固的正二十二烷上，加入2 μl的样本DNA模板，八联管管盖上加入1 μl的乙酸镁，封闭管盖。在掌上离心机Eastwin瞬时离心，使得乙酸镁掉落至RAA体系，启动RAA反应。放入荧光定量PCR仪器中。

判定结果：

（1）阴性：WT管和MUT管的所有通道都没有扩增曲线；

（2）不提示耐药（敏感）：WT管的3个通道都有扩增曲线，MUT管的4个通道都没有扩增曲线；

（3）耐药：在密码子516、526、531或533处出现具体的耐药类型，具体结果判读见表1。

三、结核分枝杆菌利福平耐药基因MLP-RAP检测方法学评价

选用1株结核分枝杆菌H37Rv标准株、10株利福平敏感结核分枝杆菌菌株及10株利福平耐药结核分枝杆菌菌株进行MLP-RAP特异性评价。上述菌株均由国家结核病参比实验室提供。

将野生型和4种突变型（D516V、H526D、H526Y和S531L）重组质粒10倍稀释，从108 拷贝/μl至100 拷贝/μl，进行MLP-RAP敏感性评价。

将野生型质粒（104 拷贝/μl）分别与4种突变型质粒（104 拷贝/μl）按照不同的比例混合，制备了含有4种不同突变类型的异质性耐药参考品。每种突变类型的异质性耐药参考品均含有0%、5%、10%、15%、25%、50%、75%和100%的突变比例。为验证异质性耐药检出能力同基因组DNA总浓度的关系，以突变型S531L为研究对象，制备了5×103和5×102 拷贝/μl的两种DNA总浓度的模板，且每种浓度的模板含有0%、5%、10%、15%、25%、50%、75%和100%的突变比例，进行MLP-RAP异质性耐药检测能力评价。

用于临床评价的标本包括126份临床分离株和78份痰标本，上述样品均来自国家结核病参比实验室，煮沸法提取核酸后备用。同时使用MLP-RAP方法、qPCR方法和巢式PCR产物一代测序方法进行检测和临床样本评估。

研究结果

一、结核分枝杆菌利福平耐药基因MLP-RAP检测方法学评价结果

MLP-RAP方法特异性良好，且检测野生型质粒和4种突变型质粒的敏感度均能达到5 拷贝/μl，以突变型S531L为例（图2）。如图3所示，MLP-RAP检测对于总浓度为104 拷贝/μl的4种突变类型（D516V、H526D、H526Y和S531L）混合模板的突变检测能力为5%；进一步的以S531L为研究对象，对于总浓度为5×103 拷贝/μl和5×102 拷贝/μl混合模板的突变检测能力仍为5%。

图2  使用不同浓度梯度的突变型S531L质粒（106、105、104、103、102、10和5 拷贝/μl）进行MLP-RAP检测。在WT管（a）中，WT1通道（b）和WT2通道（c）有扩增曲线。在MUT管（d）中，MUT3通道（e）有扩增曲线。WT1、WT2和MUT3通道的敏感度可以达到5 copies/μl。综上所述，MLP-RAP检测突变型S531L质粒的敏感度能达到5 拷贝/μl

图3  对于总浓度为104 拷贝/μl的MLP-RAP异质性耐药能力检测结果

二、结核分枝杆菌利福平耐药基因MLP-RAP检测临床样本的评价结果

如表2所示，126株MTB临床分离株中，MLP-RAP检测结果显示，39株不提示耐药，81株耐药，6株阴性；其中，81株耐药菌株中，6株存在526-TAC位点异质性耐药，1株存在531-TTG位点异质性耐药，GeneXpert MTB/RIF方法未检测到7株菌株的异质性耐药，而巢式PCR产物一代测序结果出现重叠峰，验证了MLP-RAP检出的7株异质性耐药菌株。以526-TAC位点异质性耐药为例，如图4所示。本方法能覆盖516、526、531和533位点的突变类型，并能检测到526-TAC（rpoB_H445Y）和531-TTG（rpoB-S450L）突变类型的异质性耐药。

图4  526-TAC突变类型异质性耐药的临床分离株核酸的MLP-RAP和巢式PCR产物一代测序结果

126株菌株中6株MLP-RAP检测阴性，其中4株为511-CCG（rpoB-L430P）耐药，2株为513-AAA（rpoB-Q432L）耐药。因此，MLP-RAP检测无法覆盖结核分枝杆菌利福平耐药位点511和513。MLP-RAP与表型药敏实验有1株样本不符，MLP-RAP检测为516-GTC耐药，表型药敏实验为敏感；其余125份样本两种方法检测结果一致。需要注意的是，通过耐药基因判断的耐药结果与通过传统方法获得的表型药敏试验结果并非完全一致，原因在于传统方法检测结果的不确定性，而经验证MLP-RAP方法在耐药基因检测层面上是准确的。

78份疑似肺结核患者痰标本中，41份检测结果为不提示耐药（敏感），37份为阴性；MLP-RAP检测结果与GeneXpert MTB/RIF和巢式PCR产物一代测序结果一致，一致率为100%；MLP-RAP比qPCR多检出9份样本，41份敏感标本中，32份标本qPCR的Ct值为27～35，具体见表3。采用Kappa检验对MLP-RAP和qPCR检测结果进行统计学分析。Kappa值为0.771，差异有统计学意义 (P <0.001)。

研究结论

RAP技术基于RAA快速高效扩增和qPCR多重探针检测优势，单管置于荧光定量PCR仪中，1 h内即可完成检测反应。通过检测rpoB基因516、526、531和533位点是否发生突变，检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性，RAP检测质粒灵敏度为5 拷贝/μl，较qPCR（100 拷贝/μl）提高20倍左右；且RAP技术对异质性耐药突变检测能力为5%。该方法检测利福平耐药菌株和敏感菌株的特异性好，与二代测序结果符合；痰标本RAP检测结果与GeneXpert MTB/RIF一致。RAP方法对核酸提取要求低，痰标本煮沸后可在常规荧光定量PCR仪中检测，具有很好的应用前景，可减轻结核病检测负担。研究团队目前正在将MLP-RAP策略扩展到异烟肼和二线抗结核药物的耐药性分子生物学检测；并将MPL-RAP与微流控装置相结合，实现样本处理和核酸多重扩增检测一体化全集成的微流控卡盒，从而从痰样本中筛选出耐多药结核病 (MDR-TB) 和广泛耐药结核病 (XDR-TB) 患者。

参考文献略

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供稿：张瑞卿、欧喜超

编辑：孟莉

审校：范永德

发布日期：2023-06-08

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