【中西合璧】电针通过激活局部交感神经去甲肾上腺素能信号通路缓解膝骨关节炎大鼠滑膜炎和疼痛行为

上海中医药大学附属岳阳医院麻醉科

近年来的研究热点主要集中在通过神经刺激控制局部关节炎症，以避免常规药物治疗的全身副作用。电针用于治疗膝关节骨性关节炎(KOA)已被证实具有抑制炎症和减轻疼痛的作用，但其机制尚不清楚。本研究采用单碘乙酸钠(MIA)关节腔内注射(1mg/50μL)建立KOA模型。电针采用针刺同侧足三里（ST36）及阳陵泉（GB34)穴的方法。行为学通过测量后爪负重阈值和撤爪阈值测定。造模第9天，采用HE染色、Masson染色、DIA定量蛋白质组学、流式细胞术、免疫荧光染色、ELISA、Western Blot等方法检测患肢膝关节滑膜组织学结构、富集蛋白分析、细胞因子含量、免疫细胞数量。造模后第14天用透射电镜观察患肢隐神经的超微结构。通过上述方法，结果发现：电针治疗可在关节炎症中期减轻炎症性疼痛行为和软骨损伤，但在炎症早期治疗效果不佳。炎症中期电针治疗可在MIA模型第9天时通过提高滑膜交感神经递质去甲肾上腺素(NE)的水平，而非全身NE或全身肾上腺素，抑制滑膜中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。电针诱导滑膜NE增加是通过β2-肾上腺素能受体介导的方式抑制CXCL1-CXCR2依赖的滑膜巨噬细胞IL-6的过表达实现的。以上结果表明，电针可以通过激活交感神经去甲肾上腺素能信号通路以控制KOA大鼠局部炎症，以上发现可助推新的神经刺激手段用于治疗炎症性疾病。相关成果于2023年3月发表在Frontiers in Molecular Neuroscience上,古麻今醉中西合璧专栏对该文进行编译以飨读者。

背景

膝关节骨性关节炎(KOA)是一种多因素相关的关节疾病，其症状包括关节变性、间歇性炎症和周围神经病变。抗风湿类生物制剂治疗费用昂贵，而且可能增加系统性免疫抑制、感染和恶性肿瘤的风险。最近的研究集中在控制关节局部炎症，以避免常规药物治疗的全身副作用。神经刺激的方法，如迷走神经刺激，是一种调节器官功能和重建生理稳态的新手段，其在神经系统的免疫系统调节应用方面已被广泛研究。

虽然KOA发病的确切机制和发病过程尚未完全了解，但实验观察发现软骨细胞外基质碎片可通过激活驻留的成纤维细胞或巨噬细胞诱导滑膜炎症，进而释放促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和其他炎症介质，并进一步募集其他免疫细胞，导致滑膜内层增厚和滑膜增生。此外，趋化因子及其受体在骨关节炎的病理过程中发挥着至关重要的作用，它们在循环免疫细胞向损伤部位的迁移中发挥着重要作用。在KOA患者的滑膜液中，炎症滑膜产生的CCL3可以通过CCR1趋化循环中的单核细胞。在人类OA滑膜成纤维细胞中，趋化因子(CXC motif)配体1 (CXCL1)通过CXCR2、c-Raf、MAPK和AP-1途径参与IL-6的表达。巨噬细胞是与阻塞性睡眠呼吸综合征相关的滑膜炎症活动以及软骨和骨骼病理反应的关键介质。膝关节中激活的巨噬细胞数量与影像学上OA的严重程度和症状相关。OA滑膜外植体中巨噬细胞的消耗大大减少了多种细胞因子的产生，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。

低水平的关节炎症可促进外周敏感化和痛觉性疼痛的发展。滑膜炎和基线滑膜增厚会增加OA进展的速度，并与OA患者疼痛和功能障碍增加相关。此外，早期炎症的衰减可以预防OA大鼠的疼痛和神经损伤。因此，必须找到一种抑制滑膜炎症的策略，以防止KOA患者外周敏化和伤害性疼痛的发生。

膝关节主要受感觉神经和交感神经支配。周围关节神经支配的改变被认为是关节组织退行性改变和OA发展的部分原因。有学者在类风湿关节炎患者的滑膜组织中观察到交感神经纤维的丢失。交感神经在大脑和免疫系统之间起到整合连接的作用，在炎症控制中起着至关重要的作用。有研究发现交感神经功能介导的压力反射的激活降低了意识清醒大鼠的关节炎症反应。一种局部交感神经免疫途径已被证明可以通过迷走神经刺激调节关节炎症。大脑蓝斑（LC）和延髓头端腹外侧区（RVLM）作为重要的交感神经调节中枢，也参与了帕金森病、真菌毒素诱导的炎性病变和关节炎症的抗炎作用过程。

电针已被证明对KOA患者的疼痛减轻和炎症抑制有益。然而，尚不清楚交感神经功能是否介导电针抑制滑膜炎和减轻KOA大鼠的后脚掌疼痛的作用。在本研究中，我们证实了电针对滑膜炎和膝关节疼痛的抑制作用，其机制与MIA诱导的KOA大鼠交感神经功能的激活有关。我们发现在炎性疼痛中期电针通过激活KOA大鼠的交感神经功能，抑制了MIA注射后第9天滑膜的炎症反应。电针经β2肾上腺素受体依赖的方式通过过表达IL-6增加交感神经递质水平，进而抑制CXCL1诱导的循环中单核细胞的募集及滑膜组织中巨噬细胞的增加。本研究证实电针可抑制滑膜炎，减轻KOA大鼠的炎性疼痛。

研究方法

1.动物：

所用动物为健康成年雄性SD大鼠，体重180-200 g，购自国家食品和药物研究所(医学实验动物证书编号:SCXK (JING) 2017-0005)，操作前适应环境至少1周。自由摄入食物和水。实验动物饲养于于温度(22±4℃)、湿度(60-65%)、光照(7:00-19:00)的环境中。全身麻醉在4 %异氟醚诱导下，维持麻醉在2 %异氟醚麻醉下进行。

2.关节腔注射：

实验操作时动物深度麻醉(2-4%异氟醚;100%氧气，每分钟1升)直到所有感觉反射停止。右膝关节刮掉毛发，用100%乙醇擦拭。6-OHDA (150 μg/ 50 μL，溶于含0.02%抗坏血酸的生理盐水中;如前所述，将ici118,551 (1.5 μg/ 50 μL，溶解于无菌生理盐水中)注射至关节间隙。然后手动伸展和屈曲膝关节30秒，使溶液在关节内扩散均匀。对照组大鼠右膝关节给予无菌生理盐水。

3.针刺治疗：

电针操作时，取同侧足三里及阳陵泉穴。足三里位于膝关节后外侧，腓骨头下约5毫米处。阳陵泉位于腓骨头前下凹陷处，距足三里上外侧5 mm。所选EA参数为1 mA，密疏波(2/15 Hz)，每次30 min。

4.疼痛行为检测：

肢体负重减低(WBD)测量为自发疼痛的标志。所有动物适应环境后，将实验动物置于有机玻璃箱中(型号BIO-DWB-AUTO-R;Bioseb，布洛涅，法国)将大鼠后肢放置在一个独立的受力板上(图1B)。计算同侧后爪所承受的重量占后肢所承受总重量的百分比。每个值重复三次，取平均值。

用von-Frey测量作为继发性异位疼痛的标志来测量后爪足底的触觉超敏性。这些老鼠被放置在树脂玻璃装置中，提前适应约30分钟，直到大鼠探索行为停止。采用Dixon方法评估同侧后足的抬爪机械阈值。

5.关节软骨损伤评估

关节内注射MIA后第14天处死大鼠。膝关节软骨照片利用数码相机(佳能)拍摄。两名独立观察者采用盲法对膝关节软骨表面软骨损伤进行评分，严重程度由0至4，0=外观正常，1=表面粗糙，2=软骨表面中度病变，3=软骨下骨严重病变，4=骨赘形成伴软骨下骨严重病变。每组的平均分数均固定。

6.滑膜组织病理学检测

麻醉大鼠经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛固定。灌注固定后，将收集的滑膜组织用4%多聚甲醛后固定，然后用石蜡包埋。为评估滑膜组织炎症的严重程度和结构变化，制作5μm厚的滑膜组织矢状切片，然后苏木精和伊红染色。如前所述(Liao et al.，2020)，通过观察关节内壁层增生和炎症细胞浸润的强度来观察关节关节炎的严重程度。

7.血液及滑膜组织蛋白组学分析

通过心脏取血方式进行血象分析。取血清:取全血，置于聚丙烯管中，室温凝固120 min, 2000 g离心20 min，取血浆:取EDTA抗凝管中血液，4℃，1600 g离心15 min，然后离心30 min。单独包装，保存在−80°C冰箱中用于检测，将膝关节右侧滑膜均质化，定量测定去甲肾上腺素和细胞因子水平。

采用MSD MULTI-SPOT Assay System测定炎症因子CXCL1, IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL4, IL-10, IL-13的水平。使用酶免疫分析(EIA)或ELISA试剂盒测定血浆去甲肾上腺素、肾上腺素和皮质醇的水平。根据制造商的使用说明，采用ELISA试剂盒测定滑膜去甲肾上腺素的水平。

8.免疫荧光染色

麻醉大鼠经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛进行固定。灌注后，将收集的滑膜组织用4%多聚甲醛进行后固定，然后将其包埋在人工培养液(Shandon Cryomatrix™，120mL, Thermo Fisher Scientific，USA)中，冷冻，并在冰冻切片机上切成20 μm切片(Thermo Fisher Scientific, Microm International FSE，Germany)。在0.1M PBS (pH 7.4)中初次洗涤后，将组织置于0.1M磷酸盐缓冲溶液(PB, pH 7.4)中，在3%山羊血清和0.5% Triton X-100的溶液中预孵育30分钟，以阻止非特异性结合。然后将切片与一抗(Anti-TH: Ab112;Anti c - fos: Ab208942;Anti iNOS, Ab15323;Anti-Dopamine beta Hydroxylase:Ab19353;Anti-CRF, Ab8901;其次是山羊/驴抗兔Alexa Fluor 488二抗或驴抗鼠/兔/羊Alexa Fluor 488/594二抗(1:500;分子探针)室温下孵育2h。然后用蓝色荧光DAPI核酸(1/40000,D3571, 10mg，美国Invitrogen公司)染色5min以标记细胞核。在0.1M PBS中最后冲洗后，将载玻片覆盖并用PBS -甘油封片。阴性对照在染色过程中省略一抗。用共焦成像系统(FV1200，奥林巴斯，日本)观察玻片，并使用奥林巴斯图像处理软件进行分析，研究人员事先未知切片的具体分组。每组取大约20个图像画面随机分组进行分析。每个染色组合进行免疫组化时均同时进行，以确保染色的一致性。

9.Western blot方法

膝关节滑膜蛋白标本分析采用标准western blot技术。1X TBST中一抗孵育(ADRB2A, YT5048,1:500;Adra1ayt0354,1:500;Adra2a yt0298,1:500;p-Erk1/2 #9101,1:1000;Erk1/2 #4695,1:1000;Mek #8727,1:1000;p-MEK1/2 #3958,1:1000;GAPDH #2118/#97,166,1:2000, CST) (CXCR2, bs-4836R, 1:2000;β-actin, bs-0061R:4000, bioss)过夜。将二抗(酶标亲和山羊抗兔IgG (H + L)， 1:1000, SA-00001-1, Proteintech)用1X TBST稀释，室温下摇床孵育1小时。使用ECL底物(34,080,Thermo Fisher Scientific公司)通过成像系统(ChemiDoc Touch V3, BioRad)检测蛋白条带，并使用ImageJ软件进行分析。

10.流式细胞分析

使用骨骼肌分离试剂盒(130-098-305,Miltenyi Biotec)处理大鼠膝关节滑膜组织，制备细胞悬浮液。细胞表面用藻红蛋白(PE)抗大鼠CD86和FITC抗大鼠CD11b染色(BD Bioscience，USA)。孵育后，使用流式细胞仪(FACS Celesta, BD Bioscience)进行流式细胞分析。使用FlowJo软件对数据进行进一步分析。

11.蛋白组学定量分析

如前所述收集滑膜组织，匀浆器(24 × 2,6.0 m/s, 60 s, 2次)匀浆，然后加入SDT缓冲液(100 mM DTT, 4% SDS, 150 mM Tris-HCl, pH 8.0)。裂解后研磨均匀，然后煮沸15分钟变性蛋白。在14000 × g离心40分钟后，用BCA蛋白测定试剂盒(Bio-Rad，美国)定量上清液。分离的样品用Q-Exactive HFX质谱仪(Thermo Fisher Scientific)分析。获得数据后直接导入Spectronaut软件(SpectronautTM 14.4.200727.47784)构建谱库。利用Spectronaut对DIA数据搜索预先存在的光谱库进行分析，完成后进行进一步的生物信息学分析。

12.透射电镜分析

右膝关节近端分离一段隐神经，置于4%戊二醛稀释(0.1 M cacodylate buffer)液中，4°C保存至少1周。后用0.1 M cacodylate钠缓冲液冲洗并在1%四氧化锇中固定2小时，PBS冲洗3次，然后放置在0.25%醋酸铀酰(4°C)中过夜。然后将样品在一系列丙酮中分级脱水，后将样品在100%丙酮中干燥10 min。用Epon-Araldite树脂浸润样品，然后将样品置于100% Epon - Araldite树脂中，在梯度温度下固化。最后，用LKB Huxley超显微切片机和金刚石刀将样品切成70 nm厚片。将神经横切面置于每英寸300个正方形(每个正方形大小为83 × 3 × 58 mm)的铜丝网中，然后用2%乙酸铀酰水溶液染色10分钟，接着用柠檬酸铅染色4分钟以备观察。

13.统计分析：

所有数据均以平均值±均数标准误差表示。使用GraphPad Prism 6 (GraphPad Prism Software Inc.，San Diego, United States)进行统计分析。采用双因素方差分析和Tukey的多重比较检验来评估电针对大鼠痛行为的影响。后续实验采用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验。p值<0.05时有统计学意义。

结果

1.电针可减轻单碘乙酸诱导的膝骨关节炎大鼠的中期炎性疼痛行为和软骨损伤

首先，我们观察了电针在炎症性疼痛早期(简称EA早期)的作用，从MIA注射后的第1天到第3天每天进行(图1A-E)。MIA诱导的KOA大鼠在注射MIA后第1天开始出现同侧负重不足(WBD)、后爪戒断阈值(HPWT)下降等炎症性疼痛行为，在注射MIA后第3天达到最严重，随后几天开始恢复(图1D,E)。因此，最初3天的炎症性疼痛被认为是其早期阶段。然而，早期电针并没有在干预的任何时间点缓解WBD和HPWT，甚至在注射MIA后的第1天疼痛症状出现恶化(图1D,E)。这些结果表明，早期电针不能缓解KOA大鼠的炎症性疼痛行为。

在MIA注射后的第5天到第9天，每隔一天进行一次炎症性疼痛中期阶段的电针治疗(简称中期EA)(图1A,F,G)。中期EA缓解了MIA注射后第7天和第9天的WBD，而模型组和EA组在干预的其他时间点WBD无显著差异(图1F)。WBD是一种与关节炎症相关的自发性疼痛的测量方法。然后我们观察滑膜的组织病理学改变，结果显示中期EA抑制了注射MIA后第9天滑膜的增生(图1H)。HPWT用于显示损伤关节远端的继发性痛觉敏化，这种现象是神经损伤的标志。在注射MIA后第14天，与模型组比较，中期电针组的HPWT升高，软骨损伤评分降低(图1G,I,J)，说明电针缓解了注射MIA后第14天大鼠足底的继发性疼痛过敏。由此可见，中期电针可明显缓解注射MIA后第9天KOA大鼠的自发性疼痛行为和滑膜增生，缓解注射MIA后第14天KOA大鼠的继发性痛觉敏化和软骨损伤。

Fig.1 炎症中期电针干预可减轻MIA诱导的KOA大鼠的炎症性疼痛行为。

2.电针对膝骨关节炎大鼠滑膜炎症反应的调节作用

造模第9天对大鼠滑膜进行蛋白质组学检测，根据p < 0.05和foldchange (FC) > 1.2进行筛选。共鉴定出222个蛋白表达差异位点，其中144个上调，78个下调(图2A)。GO分析表明，这些蛋白表达差异位点集中于与细胞因子表达、外源性细胞凋亡的正向调节、信号通路、急性期反应、应激激活的MAPK级联反应、正向调节fc - γ受体信号通路参与的吞噬、细胞因子介导的信号通路负向调节相关的蛋白中(图2B)。我们发现它们集中表达于与免疫调节和反应相关的方面。因此，我们重点分析了模型组和Ea组的蛋白表达差异。结果显示，在与细胞对IL-6的反应、白细胞介素-1 β产生的负向调节、细胞因子和其他调节因子的产生方面都集中表达。其余的差异表达集中在与包括细胞因子介导的信号通路的负向调节、固有免疫应答的调节、参与炎症应答的白细胞迁移、炎症应答的正向调节、MAPKK活性的激活以及ERK1和ERK2级联的调节等方面(图2C)。这些结果提示巨噬细胞分泌的细胞因子可能参与了EA对滑膜炎的调控。

Fig.2 电针调节KOA大鼠滑膜炎症反应。观察模型组与电针组滑膜炎差异表达蛋白(DEPs)的变化。

3.中期电针可以降低单碘乙酸诱导的膝骨关节炎大鼠滑膜中的促炎细胞因子的水平

为了揭示EA发挥保护作用的分子机制，我们检测了滑膜和血清中的细胞因子水平。结果显示，MIA注射后第1天促炎细胞因子CXCL1、IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高,然而，促炎细胞因子CXCL1和IL-6的水平在早期EA时增加更多(图3A)，这与早期EA不能减轻KOA大鼠炎症性疼痛行为的行为结果有关。然后我们在MIA注射后第9天通过中期EA观察细胞因子的变化。结果显示，与对照组相比，模型组促炎细胞因子CXCL1、IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平升高，而EA组则降低(图3B)。滑膜中促炎细胞因子IFN-γ和抗炎细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的水平在三组间没有显著差异(图3B)。此外，三组间血清中所有细胞因子水平无显著差异(图3C)。这些结果表明，中期EA降低了滑膜中促炎细胞因子CXCL1、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，MIA诱导的KOA大鼠的炎症仅限于关节而不是全身。

Fig.3 炎症中期EA抑制了mia诱导的KOA大鼠滑膜中促炎细胞因子CXCL1、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。

4.电针激活交感去甲肾上腺素能信号通路通过β2肾上腺素受体介导的方式抑制滑膜中CXCL1和IL-6的水平

为了明确交感神经在MIA诱导的KOA大鼠中期EA抗炎中的作用，我们测量了三组大鼠血浆去甲肾上腺素、肾上腺素和皮质醇水平，但未观察到显著差异(图4 - c)。我们检测了滑膜去甲肾上腺素水平，发现模型组滑膜去甲肾上腺素水平下降，但在注射MIA后第9天电针治疗后升高(图4D)。滑膜免疫组化染色也显示，模型组多巴胺- β-羟化酶(DBH)阳性的交感神经表达减少，电针组表达增加(图4E)。采用Western Blot技术检测注射MIA后第9天滑膜内α1、α2和β2-肾上腺素受体的表达。我们发现，与对照组相比，模型组滑膜β2肾上腺素受体表达降低，而电针治疗后其表达增加(图4F)。此外，三组间滑膜α1-肾上腺素受体表达无明显差异(图4G)。模型组和电针组滑膜α2-肾上腺素受体表达增加，但模型组与电针组无明显差异(图4H)。为了进一步确定去甲肾上腺素和β2肾上腺素受体是否参与EA的抗炎作用，我们使用化学法(6-OHDA)抑制肾上腺素能纤维及使用β2肾上腺素受体拮抗剂(ICI 118,551)评估MIA诱导的KOA大鼠滑膜行为学中同侧撤爪反应和细胞因子水平(图4I)。结果表明，关节内注射6-OHDA和ICI 118,551阻断了EA对撤爪反应降低的影响(图4J)。此外，6-OHDA和ICI 118,551消除了电针诱导的CXCL1和IL-6的表达抑制(图4K,L)。提示EA通过上调去甲肾上腺素水平，以β2肾上腺素受体介导的方式抑制滑膜中CXCL1和IL-6的水平。

由于LC和RVLM是重要的交感中枢，我们观察到EA激活LC和RVLM中的去甲肾上腺素能神经元，从LC及RVLM中c-fos 阳性 TH阳性神经元的增加可以看出(图5A-D)。下丘脑室旁核(PVN)参与交感神经功能的激活，然而，与血浆皮质醇水平的结果一致，我们并没有观察到PVN中c-fos阳性CRH阳性神经元的激活(图5E)，表明PVN并没有参与电针在KOA大鼠中的抗炎作用。

5.电针可抑制膝骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞cxcl1 - cxcr2依赖的IL-6的过表达

上述结果表明，趋化因子CXCL1和细胞因子IL-6是电针诱导抗炎作用中最重要的细胞因子。我们对这两种细胞因子进行相关分析，发现除对照组(数据未显示)外，所有组滑膜中CXCL1和IL-6水平均呈正相关(图6A)。血象分析显示，模型组循环血中单核细胞数量和百分比增加，而电针组循环血中单核细胞数量和百分比下降(图6B、C)。滑膜免疫组化染色还显示，模型组滑膜中IL-6和CD68 +巨噬细胞的共表达增加，而EA组则减少(图6D)。流式分析显示，模型组滑膜CD11b + CD86 + M1巨噬细胞数量增加，而EA组巨噬细胞数量减少(图6E-H)。

上述结果表明，EA可抑制MIA诱导的KOA大鼠滑膜巨噬细胞中CXCL1-CXCR2依赖的IL-6的过表达。然后我们检测趋化因子CXCL1受体CXCR2的表达，观察到在注射MIA后第9天滑膜中CXCR2蛋白的表达增加，而EA后CXCR2蛋白的表达减少(图7A)。免疫组织化学染色显示CXCR2+细胞与CD11b +巨噬细胞对比，EA抑制滑膜中CXCR2表达的增加(图7B)。C-Raf是一种典型的参与趋化因子受体激活的信号转换器，这些趋化因子受体包括CXCR2，及MAPK通路（包括ERK等几个关键信号元件）。我们发现EA也可以抑制KOA大鼠滑膜中ERK和MEK的磷酸化(图7C,D)。这些结果提示EA对MIA诱导的KOA大鼠滑膜炎的抗炎作用是通过MAPK/ERK信号通路抑制CXCL1-CXCR2轴介导的。

Fig.4 在MIA注射后第9天，炎症中期EA增加交感神经递质NE，以β2-AR依赖的方式抑制滑膜中CXCL1和IL-6的水平。

Fig.5 EA激活了LC和RVLM中的神经元。

6.电针可减轻MIA诱导的膝骨关节炎大鼠周围神经损伤

最后，我们在KOA大鼠注射MIA后第14天观察到周围神经损伤，这与后爪疼痛有关。注射MIA后第14天观察到隐神经脱髓鞘改变,但EA可预防隐神经脱髓鞘(图8A)。上述结果表明，KOA大鼠在MIA后第14天发生了周围神经损伤，而电针可通过抑制隐神经脱髓鞘来防止周围神经损伤。

Fig.6  EA抑制了滑膜巨噬细胞中依赖cxcl1的IL-6的过表达。

Fig.7  EA对滑膜炎的抗炎作用是通过抑制CXCL1-CXCR2轴介导的。

Fig.8 电针可减轻MIA诱导的KOA大鼠周围神经损伤，降低放电率。在MIA后第14天，对照组、模型组和电针组均拍摄了具有代表性的隐神经轴突的电子显微切片。黄色箭头表示神经髓鞘损伤;红色箭头表示雪旺细胞损伤。比例尺6mm (n=3)。

Fig.9 EA对MIA诱导的KOA大鼠抗炎作用的示意图。EA通过激活β2-AR抑制滑膜巨噬细胞CXCL1/ cxcr2依赖的IL-6的趋化和过表达。

讨论

在本研究中，中期EA通过激活交感神经去甲肾上腺素能信号通路，抑制了KOA大鼠MIA注射后第9天滑膜炎的发生。EA通过刺激交感神经递质NE的释放，以β2肾上腺素受体介导的方式抑制滑膜巨噬细胞中CXCL1-CXCR2依赖的IL-6的过表达，缓解注射MIA后第14天的后爪疼痛。我们的研究证实，EA通过激活MIA诱导的KOA大鼠交感神经去甲肾上腺素能信号，抑制滑膜巨噬细胞中CXCL1- CXCR2依赖的IL-6的过表达，从而缓解后爪疼痛。此外，MIA诱导的KOA大鼠的炎症仅限于关节局部而非全身水平。EA仅提高滑膜NE水平，而不提高全身NE或全身肾上腺素水平，从而抑制滑膜促炎细胞因子CXCL1、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，从而发挥局部抗炎作用。

近几十年来，交感神经系统(SNS)特别是其主要外周儿茶酚胺物质NE在OA发病机制中的作用越来越受到人们的关注。探究炎症性关节疾病中的SNS的作用，阐明了多种促炎和抗炎的观点：早期神经源性促炎作用和晚期免疫抑制作用。因此，干预的时间点是控制关节炎症的关键。在本研究中，早期EA（MIA后第1 -3天）既没有抑制促炎细胞因子水平，也没有减轻相应的后足疼痛，说明在MIA诱导的KOA大鼠炎性疼痛的急性期，EA对关节炎症的控制无效。我们观察到中期EA (MIA后第5 - 13天)抑制了滑膜促炎细胞因子CXCL1、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，降低了MIA后第9天后爪负重阈值，提示中期EA适合于抑制炎症性疼痛行为和滑膜炎。

滑膜细胞表达多种肾上腺素受体（AR），如α1-AR、α2-AR和β2-AR，它们可以对不同NE水平作出反应。据推测，交感神经纤维的丧失可能伴随着NE浓度的降低，导致这种神经递质主要与α-肾上腺素受体结合(亲和力更高)，而不是β2-AR。滑膜组织中去甲肾上腺素水平的降低及β2-AR通路的降调参与了佐剂诱导的关节炎大鼠中滑膜细胞的炎症反应。此外，NE可以抑制OA和RA患者滑膜巨噬细胞中β2-ARs介导的TNF-α和IL-8的分泌。β2-肾上腺素能激动剂沙丁胺醇已被确定为胶原诱导的关节炎的有效抑制剂。在本研究中，我们发现EA逆转了MIA后NE浓度的下降和β2-AR表达的降低，从而抑制滑膜炎症反应。模型组α2-AR表达增加，但在模型组和EA组之间无明显差异。因此，我们的结论为EA可以通过激活β2-AR来增加NE水平，从而抑制滑膜炎。

炎症条件下，如KOA滑膜组织炎症可以导致单核细胞的迁移及其进一步分化为巨噬细胞。在MIA诱导的KOA大鼠中，损伤相关的分子变化可以触发关节中单核细胞/巨噬细胞的招募和激活，从而促进OA症状的产生和病理的变化。在OA滑膜和软骨中，与M1巨噬细胞相关的细胞因子(如TNF-α， IL-1β和IL-6)在刺激促分解代谢介质(如聚集聚糖酶和基质金属蛋白酶)中发挥着重要作用。在炎症相关的M1型巨噬细胞激活状态下，可以导致小鼠滑膜炎症反应和软骨病理过程加重。因此，对滑膜巨噬细胞作为OA症状驱动因素的关注导致了包括清除滑膜巨噬细胞在内的治疗策略的产生。交感神经和免疫系统之间的相互作用对维持健康和稳态至关重要。激活局部结肠交感神经而不是全身交感神经可通过β2-AR介导的抑制免疫细胞外渗而减轻结肠炎。在本研究中，EA通过β2-AR介导的方式抑制了循环中单核细胞向滑膜巨噬细胞的转运，并降低了M1巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。这些结果表明，EA诱导的滑膜炎抑制是通过激活交感神经去甲肾上腺素能信号通路限制滑膜单核细胞/巨噬细胞外渗实现的。

本研究发现CXCL1和IL-6水平呈正相关，NE 抑制剂(6-OHDA)和β2-AR拮抗剂 (ICI 118,551)阻断了EA对CXCL1和IL-6的抑制作用，说明EA诱导的NE增加可以通过激活β2-AR抑制滑膜中CXCL1依赖性IL-6的过表达。趋化因子被公认参与了循环细胞向炎症组织的迁移。CXCL1作为一种重要的促炎趋化因子通过特异性结合相应的G蛋白偶联受体趋化因子(CXC基序)受体2 (CXCR2)发挥作用。CXCL1在正常生理条件下水平较低，炎症条件下CXCL1水平显著升高，OA患者中CXCL1表达增加。CXCR2可以激活多种信号通路，如PI3K/Akt、PLC/PKC、MAPK、ERK、P38和JAK/STAT3通路。MAPK蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员，通常被促炎细胞因子刺激所激活，而当其激活后又可以进一步促进炎症介质的产生。趋化因子CXCL1通过激活CXCR2、c-Raf、MAPK和AP-1通路导致KOA患者滑膜组织细胞因子IL-6的过表达。我们的研究结果表明，CXCL1/CXCR2轴触发MAPK信号通路的激活，包括MEK和ERK蛋白，促进滑膜炎，而EA可以抑制这一信号通路，并且EA逆转了巨噬细胞中CXCR2表达的增加。CXCL1是导致巨噬细胞趋化的主要因子，这一作用通过与CXCR2的结合实现。总之，我们的研究表明，EA通过激活交感神经去甲肾上腺素能信号通路，抑制了cxcl1 - cxcr2依赖的巨噬细胞趋化和滑膜中IL-6的过表达(图9)。

目前已有几种方法研究蓝斑的中枢和外周神经炎症之间的关系。LC-NE系统的中枢激活导致整个大脑的中枢释放NE，从而诱导外周交感神经输出增加，包括从扩张的交感神经末梢和肾上腺髓质释放肾上腺素。在功能上，两个交感神经兴奋性脑区——PVN/CRH和LC/NE/交感神经系统——参与了一个正反馈回路的形成。但本研究中PVN未见c-fos 阳性 CRH阳性神经元，血浆肾上腺素、皮质醇水平未见明显变化，结果表明，蓝斑（LC）下行传导通路的完整性对EA介导的关节炎炎症反应的控制至关重要，这与之前一项关于LC下行传导通路在实验性关节炎中的抗炎作用的研究一致。

低水平的炎症反应被认为参与了退行性改变及外周敏化和伤害性疼痛的发展。如IL-6和TNF-α等促炎细胞因子已被证明可以诱导关节伤害感受器的外周敏化，并增强疼痛感觉。KOA疼痛与CXCL1、IL-6之间的显著相关性也有报道。已证实大麻二酚对早期炎症的减弱可以预防大鼠OA的疼痛和神经损伤。在本研究中，EA抑制了MIA后第9天滑膜炎症，减轻了MIA后第14天的后爪疼痛。因此，EA可通过减轻中期炎症来预防KOA大鼠后期的相关疼痛，但其作用机制有待进一步研究。

总之，我们的研究证实了EA对KOA大鼠抗炎作用的影响，并揭示了交感神经去甲肾上腺素能信号转导的相关机制。我们的研究也有助于开发新的治疗炎症性疾病的手段。

小结

综上所述，上述研究表明，在炎症性疼痛的中期，EA通过激活滑膜中的交感神经递质NE及其β2-AR，而非增加循环中的全身NE或肾上腺素，以抑制注射MIA后第9天滑膜巨噬细胞中cxcl1 - cxcr2依赖的IL-6的过表达，并减轻注射MIA后第14天的后肢疼痛，从而对MIA诱导的KOA大鼠炎症性疼痛产生局部作用。

中西合璧述评：

关节滑膜及周围组织炎症、变性及增生可引起膝关节疼痛及周围组织的退行性病变，严重影响患者生活质量。针刺用于治疗膝关节疾病历史悠久，其镇痛效果也得到了肯定。然而，其发挥疗效的机制仍值得进一步探究。本研究以MIA致炎物质引起的大鼠KOA模型为研究对象，通过观察炎症不同时期电针前后大鼠的疼痛及负重行为，及局部滑膜组织的形态、巨噬细胞相关的炎症因子及其受体的表达变化探究针刺镇痛及改善炎症作用的分子机制。实验设计合理、逻辑清晰，较为深入地研究了电针通过交感神经去甲肾上腺素系统发挥抗炎及镇痛作用的机制。然而，作者在证明巨噬细胞来源的CXCL1-CXCR2依赖的IL-6的过表达在炎症及疼痛中的作用时并未观察抑制CXCL1及敲除CXCR2后IL-6表达的变化，另外，在观察滑膜局部去甲肾上腺素通过β2-AR发挥作用时，虽未观察到循环中儿茶酚胺的水平变化，但亦不能排除其对局部肾上腺素受体作用的影响，属美中不足。未来进一步探究针刺改善膝关节炎症及疼痛的分子机制必将为针刺在临床中的应用奠定更为坚实的基础。

翻译：崔鹏

述评：许华

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