8+！基于结直肠癌转移和免疫相关基因对的新型预后特征~

导语

转移仍然是结直肠癌(CRC)患者死亡的主要原因。免疫微环境在CRC转移的起始和进展中的关键作用已引起广泛关注。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者基于公共数据库开发了一个三基因对特征来预测CRC的预后，并在多个验证集中实现了其有效性。文章发表在《Frontiers in Immunology》上，影响因子为8.786，文章题目为：A novel prognostic signatures based on metastasis- and immune-related gene pairs for colorectal cancer。

数据介绍

共有来自癌症基因组图谱(TCGA)的453名CRC患者被纳入作为训练集，GSE39582、GSE17536、GSE29621、GSE71187被纳入作为验证集。

本研究技术路线如图1所示。

图 1

结果解析

01、鉴定差异表达的mRNA

本研究首先对TCGA-CRC公共数据库中的612例转录组分析进行了差异表达分析，并鉴定出7,980个差异表达基因（图 2A）。随后分析了CRC样本的转移相关基因并鉴定了469个差异表达基因（图 2B）。为了获得免疫浸润的程度，使用CIBERSORT和ESTIMATE算法来量化CRC组织中免疫细胞的活性或富集水平。CRC患者根据免疫评分和基质评分分为高免疫组、中免疫组和低免疫组（图 2C）。本研究进一步分析了高免疫组和低免疫组之间的差异表达基因，获得了3,177个差异表达基因（图2D）。对上述差异表达基因进行交集，最终鉴定出161个与CRC转移和免疫相关的差异表达基因（图2E）。

图 2

02、风险模型的构建和验证

通过迭代循环和基于表达的0或1分配将161个差异基因转化为基因对，然后通过单变量cox回归筛选出35个预后基因对。随后的LASSO回归与多因素cox回归分析共有三个基因对包含在Cox比例风险模型中（图 2F-H）。

为了评估模型的有效性，本研究计算了接受者操作特征曲线在1、2和6年时的曲线下面积(AUC)，并取最佳AUC对应的截止值作为评估患者风险的点（图 3A）。根据临界值，TCGA-CRC数据集中的患者被分为高风险组和低风险组，并进行K-M分析以研究模型的预后性能。高风险组患者的生存时间明显短于低风险组，表明三基因对模型在训练数据集中具有良好的预后预测效率（图 3B）。此外，模型的预后性能通过独立验证集GSE17536、GSE29621、GSE39582中的K-M分析进行了验证,和GSE71187(图 3C–F)。这些结果表明三基因对模型在训练集和多个独立的验证集上具有良好的预后预测效率。

图 3

03、风险模型的临床评估

接下来，为了探索验证集中模型与临床特征之间的关系，使用Wilcoxon符号秩检验来分析风险组与患者年龄、性别、肿瘤分期和TNM分期之间的相关性（图 4A）。卡方检验结果揭示了风险评分与转移之间的关联（图 4B）。本研究发现基于模型的风险评分与患者年龄（图 4C）和性别（图 4D）无关，而肿瘤分级（图 4E）、T分期（图 4F）、N期（图 4G）和M期（图 4B、H）与风险显著相关。考虑到从数据集中识别的基因参与免疫反应，本研究通过Spearman相关分析调查了风险模型是否与肿瘤微环境相关（图 5A）。与低危组相比，高危组的免疫浸润程度明显更高（图5B），CD8+T细胞、肿瘤相关成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞浸润更多，CD4+T细胞浸润更少（图 5C–G）。

图 4

此外，在分析风险评分与癌症靶向药物的相关性时，本研究发现PARP抑制剂Rucaparib、Olaparib和FH535的IC50在高危组中显著低于低危组，提示高危人群对PARP抑制剂更敏感（图 5H）。高风险评分与临床常用的顺铂、伊马替尼和厄洛替尼的较低IC50相关（图 5I）。

图 5

04、CTSW和FABP4作为CRC的潜在治疗靶点

在构成风险模型的五个基因中，本研究根据初步实验和现有报告，重点关注两个基因，CTSW和FABP4，作为CRC免疫和转移的潜在靶点。TCGA-CRC数据按照CTSW表达量排序，前25%的高表达数据和后25%的低表达数据纳入GSEA富集分析。除了丰富的免疫反应和上皮-间质转化(EMT)相关过程外，还发现差异表达基因与DNA损伤和双链断裂有关（图 6A）。本研究还通过TIMER预测了CTSW与免疫细胞的相关性，结果显示CTSW与CD4+T、CD8+T、巨噬细胞和树突状细胞显著相关（图 6B）。为了通过实验验证本研究的生物信息学分析结果，通过CRISPR-Cas9生成了CTSW-KO HT-29和HCT-116细胞，并通过蛋白质印迹分析验证了敲除效率（图 6C）。

接下来探讨了EMT相关蛋白与CTSW之间的关系。与阴性对照（NC）相比，CTSW-KO细胞中N-cadherin和MMP9的表达增加，而E-cadherin则相反，这也与之前的筛选结果一致（图6D）。Transwell测定还证实了与对照相比，CTSW-KOCRC细胞的迁移能力增强（图 6F）。鉴于GSEA分析结果表明CTSW表达水平与CRC肿瘤内的DNA损伤通路之间存在关联，接下来本研究探讨了CTSW与干扰素基因(STING)通路的环GMP-AMP合酶(cGAS)刺激物之间的潜在关系，结果显示，CTSW敲除显著降低了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白表达，提示CTSW在激活免疫反应（图 6E）。上述结果提示CTSW除免疫浸润外与CRC转移相关，提示其在CRC发生发展中的重要作用。

图 6

FABP4是一种与脂肪酸摄取、转运和代谢相关的脂肪酸结合蛋白。根据FABP4表达水平对TCGA-CRC样本进行排序，并分别取高低25%的转录组数据进行GSEA分析。与CTSW的结果类似，FABP4相关基因不仅与转移和免疫反应相关，而且与DNA双链断裂和错配修复相关（图 7A）。TIMER的结果还表明，FABP4与CD4+T、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞密切相关（图 7B）。随后，通过CRISPR-cas9系统构建FABP4基因敲除的CRC细胞，并通过蛋白质印迹法验证（图 7C）。发现Ecadherin表达上调，而N-cadherin和MMP9表达在FABP4敲低的CRC细胞中下调（图 7D）。与NC相比，FABP4敲除减弱了CRC细胞的迁移和侵袭能力，表明FABP4可能促进CRC转移（图 7F）。考虑到FABP4与DNA损伤修复相关，探索了FABP4与cGAS-STING通路之间的关联。cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表达水平在FABP4-KO细胞中显著降低（图 7E）。引人注目的是，通过免疫组织化学检查了来自35名CRC患者的组织微阵列样本中的FABP4和CD8表达，表明FABP4表达升高的患者中CD8浸润增加（图 7G）。这些发现表明FABP4与免疫反应和转移密切相关，可能成为CRC的潜在治疗靶点。

图 7

小编总结

基于正常/肿瘤、高/低免疫细胞浸润和转移/非转移组，本研究鉴定了161个差异表达基因。经过随机分配和LASSO回归分析，构建了一个包含3个转移和免疫相关基因对的预后模型，并在训练集和4个独立的 CRC队列中表现出良好的预后预测效率。根据这个模型，本研究对患者进行聚类，发现高危组与分期、T和M分期相关。此外，高危人群还表现出较高的免疫浸润和对PARP抑制剂的高敏感性。此外，源自本模型的FABP4和CTSW被鉴定为参与CRC的转移和免疫。本研究缺陷在于所用数据集不足，结果的应用有限制，仍需要更多后续的实验证明。

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