陈功团队：治病救人，团结一致转分化

撰文丨陈功团队（陈功，雷文亮，李雯，李智飞，吴政）

细胞转分化是重要的科学发现

细胞转分化

是现代再生医学的一个重要里程碑，其科学原理是利用转录因子（或小分子）将一种细胞转化为另一种细胞，其杰出代表是山中伸弥团队用四个转录因子将皮肤细胞转化为多功能干细胞【1、2】。在过去的数十年里，科学家已经成功地运用各种转录因子在体外或者体内实现了细胞之间的转分化。体外和体内的细胞转分化为现代再生医学奠定了新型的细胞治疗基础，给千千万万的患者带来了新希望。陈功团队早在2013年底就率先发表了运用神经转录因子NeuroD1在老年痴呆症小鼠脑内将应激性星形胶质细胞原位转分化为功能性神经元【3】，并且开创了通过AAV载体递送NeuroD1和其他转录因子的神经再生型基因疗法【4-7】。

与此同时，陈功团队也报道了由星形胶质细胞启动子GFAP驱动的对照病毒AAV 并不是百分百地表达在星形胶质细胞里，而是有一小部分报告蛋白（GFP/mCherry）也会表达在神经元里（通常在十分之一左右，与病毒剂量紧密相关）【4、5】，这一现象被称为“神经元泄漏”。在运用谱系示踪小鼠进行转分化实验时，陈功团队发现弱启动子GFAP很难将谱系示踪的星形胶质细胞转化为神经元，需要用CMV增强子来加大NeuroD1的表达量，才能够把谱系示踪的星形胶质细胞转化为神经元【8、9】。

最新未发表的转录组分析显示，谱系示踪的小鼠和正常的小鼠在转录组层面有很大的差别，可能解释为什么谱系示踪的星形胶质细胞难以转分化。目前，NeuroD1介导的转分化已经被国际上多个团队反复验证【10-14】，具有潜在的临床应用价值。

成功的转分化需要找到合适的转分化条件

转分化能否成功以及转分化效率的高低，与神经转录因子的选择及其表达强度密切相关。有团队研究显示，NeuroD1表达量越高则其转分化效率也越高【12】；如果使用CMV-enhancer（增强子）可以进一步增强转录因子的表达并提高转化效率【9】。而转分化的成功又是和神经组织修复以及功能恢复密不可分的。 陈功团队前期研究显示，通过AAV将NeuroD1或其他转录因子表达在应激性星形胶质细胞中，可以在脑卒中、亨廷顿舞蹈症、颞叶癫痫等动物模型中修复神经组织、促进功能恢复【4-7】。伴随着胶质细胞的转分化，陈功团队还观察到炎症反应的降低、胶质瘢痕的减少以及血脑屏障的恢复【4、6、15】。其他研究团队通过不同的病毒表达系统将NeuroD1表达在脑卒中模型动物的应激性星形胶质细胞中也实现了神经再生和功能的改善【10、14】。

这些不同研究团队的工作，都证实了靶向应激性星形胶质细胞表达NeuroD1等神经转录因子对于中枢神经损伤具有显著的修复效果。近年来，有少数研究在运用谱系示踪小鼠进行转分化实验时，不了解经过DNA剪切过的谱系示踪的星形胶质细胞其转录组已经发生了很大的变化，难以实现高效的转分化，在没有使用增强子的情况下，仅仅用了一个GFAP弱启动子就宣称自己做不出转分化来。本来做不出转分化也不是什么大不了的事，可以本着科学的态度去认真思考为什么做不出来，缺少了什么关键因素？如何通过调控转录因子的表达来实现成功的转分化？科学的争论原本很正常，可以推动科学的发展，因为真理总是越辩越明的。当一方指出另一方的实验缺陷，另一方马上去验证，真相就会大白的。如果只是因为没有想到使用增强子或者其他的调控方法来增加NeuroD1的表达量，所以没有做出转分化，倒也情有可原。但是，在已经得知陈功团队运用CMV增强子加强NeuroD1表达可以将谱系示踪的星形胶质细胞转化为神经元之后【8、9】，仍然拒不使用增强子来验证自己的实验，却还在持续发表弱启动子转化不了谱系示踪的星形胶质细胞的工作【16】，并且在各个媒体上报道做不出转分化来，这显然不是正常的科学争论。

双光子活体成像解码转分化的动态过程

古语云：“眼见为实”。针对质疑，陈功团队还开展了双光子活体成像实时追踪NeuroD1介导的胶质细胞原位转分化的研究。实验发现，星形胶质细胞谱系示踪小鼠 （Aldh1l1-CreERT2x Rosa CAG-LSL-tdTomato） 中被tdTomato报告蛋白标记示踪的星形胶质细胞在表达NeuroD1后逐步由典型的放射状短分支的胶质细胞形态转变为单极或双极的神经元形态，且有生长锥和树突棘等神经元亚细胞结构出现，并在后续的免疫组化染色中被证实表达神经元特异标志物NeuN【9】。未发表的数据还显示，双光子活体钙成像技术发现NeuroD1介导的胶质细胞原位转分化所新生的神经元能够与周边内源性神经元同步发放钙波信号，提示这些新生的神经元已经整合融入了局部的功能性神经环路之中。因此，小鼠脑内双光子实时影像追踪的实验清晰地显示了NeuroD1介导的星形胶质细胞原位转化为神经元的动态过程。

转分化的分子机制

转分化的分子机制目前也已经明了，就是在转录因子的作用下，起始细胞的转录组逐渐转化为目标细胞的转录组。陈功团队运用转录组测序分析揭示了NeuroD1介导的星形胶质细胞转分化的分子机制，发现NeuroD1会引发胶质细胞中转录组的急剧变化，下调星形胶质细胞相关基因，同时上调神经元相关基因的表达，从而将星形胶质细胞的转录组转化为神经元的转录组【17】。此外，陈功团队还报道了NeuroD1介导的星形胶质细胞转分化过程中存在中间态，也就是在转分化的早期，转化过程中的细胞能够同时表达星形胶质细胞特异性标志物GFAP和神经元特异性标志物NEUN【7】，而这种兼具胶质细胞和神经元双重特性的细胞在成年大脑内是没有的。因此，中间态细胞的出现是NeuroD1诱导星形胶质细胞向神经元转分化的重要证据之一。

病毒泄漏是一个普遍现象，不能用泄漏来否定转分化

病毒泄漏现象其实不是什么新发现。对AAV深入研究过的学者都知道，AAV从来就不会百分百地专一表达在某一种特定组织中，世界上也没有哪一个启动子能够百分百地保证只在一种细胞里表达。因此，使用任何一种启动子的AAV都有可能表达在不止一种细胞里，科学家所能做的无非是尽量增加靶标细胞的感染效率，同时降低非靶标细胞的泄漏比例。而泄漏的比例和AAV的剂量，特别是AAV的滴度密切相关：AAV剂量越大，对神经组织的损伤也越大，泄漏比例就越高【9】。同时，转分化和AAV剂量也成正相关：装载转录因子的AAV剂量越大，转分化效率越高，但泄漏比例也会随之越高。因此，既要实现高效的转分化（需要高剂量）又要降低泄漏比例（需要低剂量）就成了一个悖论，只能寻找一个平衡点，在可以接受的泄漏范围内（比如<10%）去尽量实现高效的转分化。 转分化和泄漏是并存的关系，而不是相互排斥的关系。比如，在Wang et al.【18】的文章里，用逆向标记的方法发现NeuroD1转化的神经元里有37.5%是原先标记的神经元，也就是说泄漏比例为37.5%，那么还有62.5%的神经元是哪里来的呢？既然NeuroD1在早期都是表达在星形胶质细胞里的，那么怎么可能排除这62.5%的非泄漏的神经元是从星形胶质细胞转化而来呢？ 事实上，该论文作者没有提供任何证据表明，因为泄漏的存在，转分化就消失了。其他多个团队都各自独立地证实了NeuroD1的转分化能力【10-14】，特别是通过只感染分裂型胶质细胞的逆转录病毒来表达NeuroD1，以及在体外培养的人源星形胶质细胞里表达NeuroD1实现的转分化【3】，这两种情况下都没有神经元泄漏的条件，也就毋庸置疑地证明了NeuroD1的转分化能力。

NeuroD1不是神话，是一个成功的转化因子

综上所述，成功的转分化就是要去寻找合适的转化因子将一种细胞转化为另一种细胞。如果你的转分化不成功，就意味着你还没有找到合适的转化因子或者你所使用的剂量不合适。转分化不成功，就应该沉下心来，分析原因，找出哪里没有做对，失败了再试验，直到成功！ 在此我们呼吁，转分化领域的学者应该停止内耗，总结失败教训，团结一致去攻克那些难以转分化的难题。比如，陈功团队在其第一篇 Cell Stem Cell论文【3】里就报道了NeuroD1不能将小胶质细胞（Microglia）转化为神经元（Suppl Fig. 6），只能将星形胶质细胞和NG2细胞转化为神经元，因为小胶质细胞不是从神经干细胞分化而来。但Matsuda et al.【19】报道可以用NeuroD1转分化小胶质细胞，并且在其文章中讨论了陈功团队的前期阴性结果，然后Rao et al. 【20】 在2021年又发文反驳了Matsuda et al.【19】，支持了陈功团队早期的发现【3】，也就是NeuroD1不能够转分化小胶质细胞。那么接下来更重要的问题是，能否通过增强子或者增加其他的转录因子来最终实现小胶质细胞的原位转分化呢？小胶质细胞和免疫炎症反应密切相关，如果能够把小胶质细胞在体原位转化为神经元，或许有益于某些神经疾病的治疗。 我们做转分化的目的就是要实现原位神经再生，治病救人。过去十年的转分化研究已经从理论上告诉我们，任何一种细胞都有可能被转化为另一种细胞，而我们的工作就是要去探寻实现成功转分化的金钥匙。

参考文献：

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