冻存10年的NK细胞还有活性吗？不同来源的NK细胞对比

近年来，免疫细胞在抗肿瘤、抗病毒和抗衰老的临床研究与转化中受到越来越多的关注，尤其在肿瘤生物治疗方面取得了很大的进展。

在进行免疫细胞与化疗联用时，在化疗前先采血，待到化疗后7-15天左右再进行回输，以保证免疫细胞治疗的效果。

极个别情况下，为避免后续无法满足采血的条件，外周血来源NK细胞需要短期冻存，留待下次使用；而脐带血来源的免疫细胞作为“现货”型，是长期处于低温冻存状态的。

那么，问题来了，经过低温冻存的免疫细胞在什么时间内才不影响它的功能和活性？其实，外周血和脐带血来源的，有着显著的差异。

接下来，以NK为例，具体探讨外周血来源和脐带血来源的NK细胞经过低温冻存前后细胞表型及功能的变化，为大家揭开困惑。

外周血来源NK细胞-80℃短期冻存12周内NK细胞活性无明显变化

一项“-80℃短期冻存对NK细胞功能及杀伤活性的实验研究”的报导，探讨了-80℃短期冻存不同时间对NK细胞及杀伤活性的影响。

研究人员采集和分离健康人外周血单个核细胞，在体外培养扩增细胞，扩增12天后将部分NK细胞于-80℃冻存1/4/12/24周。

通过流式细胞仪分析冻存不同时间的NK细胞的表型、凋亡百分率、颗粒酶B、穿孔素及CD107a表达。如下图所示，-80℃冻存24周的NK细胞与未冻存的NK细胞的表型、活性、颗粒酶B、穿孔素及CDl07a表达相比，差异有统计学意义(P<0.05)。而-80℃冻存12周内的NK细胞与未冻存的NK细胞各组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

研究人员进一步研究冻存不同时间的NK细胞对食管癌细胞株杀伤活性的影响。取冻存前后的NK细胞作为效应细胞，复苏的食管癌细胞为靶细胞，在效靶比为10：1时未冻存的NK细胞与冻存1、4、12、24周的NK细胞的杀伤活性分别为63.78％、62.03％、61.87％、60.94％、52.67％。冻存24周的NK细胞与未冻存NK细胞的杀伤活性比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

研究表明，-80℃冻存12周以内的NK细胞与未冻存的NK细胞比较，在表型和凋亡百分率方面均无明显变化，且细胞功能及杀伤活性也无明显改变，而肿瘤患者化疗的一个疗程大约为4周，因此-80℃冻存细胞可以满足大多数患者的需要。

脐带血来源的NK细胞冷冻10年扩增能力和效应功能没有影响

脐带血中NK细胞含量丰富，所占比例是外周血的3倍，也是NK细胞很有前途和无创的来源。脐带血往往需要长期冷冻，那么其用于NK细胞体外扩增是否还具有活性呢。一项发表在《J Immunother》杂志上的研究表明，从长期深低温保存的NK细胞并不影响它的扩增能力和抗肿瘤活性。

研究人员从脐带血中分离并体外扩增了大量激活的NK细胞，根据冻存时间长短，将脐带血分为三个组别：长期组（深低温冻存1-10年）、短期组（深低温冻存小于1年）、未冻存组（未经冻存的脐带血），然后对这些NK细胞杀伤乳腺癌细胞的作用进行了观察其扩增潜力和抗肿瘤效应功能。

研究发现，培养28天后，未冻存组、短期组、长期组的脐带血来源NK细胞都产生了类似的、稳定的指数级别扩增量，没有显著差异。同时离体扩增的脐带血来源NK细胞具有增加的激活标志物的表面表达，并通过产生稳定水平的促炎细胞因子，干扰素γ和肿瘤坏死因子-α显示出有效的抗肿瘤功能。

此外，扩增的CB-NK细胞显示出对来自三阴性乳腺癌和雌激素受体阳性/孕激素受体阳性乳腺癌患者的原发性乳腺癌细胞的细胞毒性。

研究表明，长期冷冻保存对扩增的脐带血来源NK细胞的扩增潜力或效应功能没有影响，长期冷冻保存的CB在临床上仍然可用于治疗性NK细胞的离体扩增。

总结

肿瘤免疫细胞治疗正迅速发展，未来免疫细胞的用途越来越广，健康的免疫细胞是培养扩增的必须条件，因此来源上不断扩宽，不局限于外周血，脐带血中同样含有丰富的免疫细胞。

脐带血NK细胞来源广、易采集、 免疫原性低、组织相容性好，细胞较原始状态，增殖能力更强，靶向杀伤癌细胞的效率也更高。

脐带血来源的NK细胞收集和冷冻保存更加便捷，长期冷冻保存对脐带血 NK 细胞的扩增潜能和抗肿瘤活性都没有影响。而外周血NK细胞在短期（12周内）冻存是没有影响的，局限性较大。

患者可灵活选择在合适时间内复苏NK细胞进行回输，保证患者的疗效，为肿瘤患者争取更多的免疫细胞治疗的机会。

参考文献：

1.-80℃短期冻存对NK细胞功能及杀伤活性的实验研究.徐州医科大学学报.2018

2.Ex Vivo-expanded Natural Killer Cells Derived From Longterm Cryopreserved Cord Blood are Cytotoxic Against Primary Breast Cancer Cells.Journal of immunotherapy.2018

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