高分综述丨J HEPATOL(IF:30): 肝胆疾病中的真菌感染和真菌微生物组

编译：微科盟可爱多，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

肝脏和胆道疾病影响着全球数十亿人，并伴随着高发病率和高死亡率。肠道细菌微生物组对这些肝病的影响已经得到了很好的证实。然而，真菌微生物组的影响长期以来一直被忽视。最近，一些研究揭示了真菌菌群在肝胆疾病发生和发展中的作用。特别是，已发现念珠菌属真菌与多种肝胆疾病的发病机制有关。本综述比较了真菌微生物组的定植和感染，描述了健康状态下和各种肝胆疾病中的真菌菌群，并指出了其共同性。本文详细介绍了对真菌抗原的免疫反应的定量如何用于预测疾病的严重程度，例如使用抗酿酒酵母抗体或特异性抗白色念珠菌抗体。还展示了真菌产物(如β-葡聚糖、念珠菌溶素)如何激活宿主的免疫系统，从而加剧肝脏和胆道疾病。最后，探讨了如何通过调节肠道真菌菌群来改善肝胆疾病。

论文ID

原名：Fungal infections and the fungal microbiome in hepatobiliary disorders

译名：肝胆疾病中的真菌感染和真菌微生物组

期刊：Journal of Hepatology

IF：30.083

发表时间：2022.12

通讯作者：Bernd Schnabl

通讯作者单位：美国加州大学圣地亚哥分校医学系

DOI号：10.1016/j.jhep.2022.12.006

综述目录

1 前言

2 定植与感染

3 真菌与细菌的关系

4 肝胆疾病中的粪便真菌菌群

4.1 原发性硬化性胆管炎

4.2 原发性胆汁性胆管炎

4.3 胆囊疾病

4.4 酒精相关性肝病

4.5 非酒精性脂肪性肝病

4.6 病毒性肝炎

4.7 肝硬化

4.8 肝细胞癌

4.9 肝胆疾病对真菌抗原的免疫反应

4.10 对念珠菌溶素的免疫反应

5 真菌导致肝胆疾病的机制

6 肝胆疾病中真菌菌群的治疗调节

7 结论  

主要内容

1 前言

2017年，全球有15亿人患有肝硬化和其他慢性肝病，最常见的原因是非酒精性脂肪肝(NAFLD，占比59%)、乙型肝炎病毒(HBV，占比29%)、丙型肝炎病毒(HCV，占比9%)、酒精相关性肝病(ALD，占比2%)以及其他疾病(占比1%)。肝硬化目前是全球第11大最常见的死亡原因，每年有200万人死于肝硬化，估计占全球死亡率的3.5%。2017年，30600人患有胆囊和其他胆道疾病，803000人患有肝癌，肝癌年发病率为953000人(HBV，占比42%；HCV，占比27%；饮酒，占比15%；NAFLD，占比8%；其他，占比8%)。

研究表明，肝胆疾病与肠道细菌失调有关，肠道细菌失调被定义为细菌亚群失衡及其对定植宿主的相关有害影响。每克粪便中含有1011个细菌细胞，而每克粪便最多含有105-106个真菌细胞、109-1010个病毒样颗粒(VLPs)或108-1010个古菌细胞。与细菌相似，真菌在小鼠和人类(远端)结肠中的密度最高。人体内细菌细胞总数约为38×1012，病毒的数量是细菌的10倍，人体内病毒总数为380×1012，而真菌细胞的数量则接近2×108(图1A)。同样，人类肠道中的细菌基因超过2200万个，比整个人体中的宿主基因(估计有6.3万个基因，其中2万个是蛋白质编码基因)多得多。肠道微生物组中真菌基因的确切总数尚不清楚；但我们可以假设，人类肠道中真菌基因的总数至少等于宿主基因的总数，因为重要的真菌物种，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)，每个至少有6000个基因，而其他真菌每个都拥有20000多个基因。尽管真菌在微生物组的细胞数量和基因数量中所占比例相对较小，但它们在健康和疾病中发挥着重要作用。真菌界包括多达600万个种，据报道，其中约625种感染脊椎动物，200种可能与人类有关，既可以作为微生物组的共生体和成员，也可以作为引起传染病的病原体。一些真菌(如C. albicans、皮炎芽生菌Blastomyces dermatitidis和荚膜组织胞浆菌Histoplasma capsulatum)可以是二态的，即它们可以从单细胞非侵入性酵母形态转换为多细胞更具致病性和侵入性的菌丝形态(称为相变)。真菌还能够形成生物膜，这可能会使它们对抗菌剂产生耐药性，难以根除，例如在留置医疗器械的环境中。在形态上，真菌通常比细菌大100倍，长10倍，通常平均长度为2-25 μm，而细菌为2-3 μm，病毒为20-200 nm，古菌为1-5 μm，人类细胞为10-30 μm(图1B)。这种大小差异表明，尽管真菌的细胞计数低于细菌，但真菌对肠道微生物组的贡献相对较大。

基于培养的方法善于检测优势真菌物种，但忽略了数量较少且无法培养的真菌群落。使用非培养方法来确定真菌多样性，包括针对真菌核糖体RNA(rRNA)的18S、内转录间隔区(ITS)1、ITS2和26S/28S的高通量测序方法，以及全基因组鸟枪测序。据报道，ITS目标区域优于18S和26S rRNA区域，基于ITS2的测序通过更准确地识别关键真菌类群而优于基于ITS1的测序。然而，所有当前的方法在检测中都有一些偏差，例如ITS1引物有利于担子菌的扩增，ITS2引物有利于子囊菌。因此，为了减少这种偏差，建议使用不同引物对的组合或平行分析ITS区域的不同部分(例如ITS1、ITS2、ITS3、ITS4引物)。定量聚合酶链反应(qPCR)或适当环境下的培养可以进一步证实这一发现。然而，大多数研究一次只依赖一种方法。

本篇综述将比较定植和感染，描述肝脏和胆道疾病患者中真菌菌群的变化，并详细介绍真菌导致肝胆疾病的机制。  

图1

真菌微生物群的数量及其与其他微生物群的比较。(A)估计人体内和人体表面的微生物总数。病毒(380×1012)是细菌(38 ×1012)的十倍，而细菌本身的数量可能是真菌(约2×108)的20万倍。由于与病毒(蓝色)和细菌(绿色)相比，真菌亚群的数量非常少，因此在图中看不到真菌亚群(黑色)。(B)细菌、真菌、病毒和古菌的典型长度。真菌(2–25 μm)通常比细菌(2–3 μm)和古菌(1–5 μm)大10倍，比病毒(20-200 nm)大得多。  

1.1 健康个体的真菌菌群  

人类微生物组计划表明，与人类肠道中的细菌多样性相比，真菌多样性显著降低，个体间和个体内变异性较高。然而，已经发现了一个核心肠道真菌群，包括念珠菌(特别是白色念珠菌)、酵母菌(特别是酿酒酵母)、青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)、隐球菌(Cryptococcus)、马拉色菌(Malassezia，特别是Malassezia restricta)、枝孢菌(Cladosporium)、半乳糖霉菌(Galactomyces)、Debaryomyces和毛孢子菌(Trichosporon)。值得注意的是，只有少数真菌能够定植于肠道(包括念珠菌和半乳糖霉菌)，而其他来源于饮食(如酿酒酵母)或环境(曲霉菌)的真菌是可检测的，并可能影响肠道生态。肠道真菌菌群是通过早期母婴转移建立的；转移也可以通过阴道分娩(例如白色念珠菌)或通过唾液或皮肤接触(例如马拉色菌)发生。有强有力的证据表明，肠道真菌群落是由营养动态塑造的。素食与人类念珠菌的相对粪便丰度显著增加有关，而动物性饮食与青霉菌显著增加以及Debaryomyces和念珠菌的减少有关。肠道真菌群落也受到药物治疗、地理位置、口腔卫生以及种族、城市化和生活方式的影响。已发现短链脂肪酸(SCFA)通过刺激肠粘膜免疫抑制白色念珠菌的生长；曲霉菌也与饮食中SCFA含量呈负相关。值得注意的是，真菌能够合成维生素B和维生素D，从而影响和塑造宿主的免疫系统。

2 定植与感染  

当体表微生物的存在和增殖不会在宿主中引起特异性免疫应答或感染时，就会发生定植。也就是说，已知健康人体会产生针对各种定植微生物(包括白色念珠菌)的抗体，因此上述定义可能必须进行调整，以使定植微生物不会引起临床上明显的免疫反应。然而，当药物和宿主之间的关系发生变化时，例如当胃肠道的正常微生物群在微生物易位的情况下进入血液时，就会导致感染。感染是指有害/致病微生物侵入人体组织而导致疾病。临床上，感染通常伴有发热、心动过速、白细胞增多、炎症标志物(如C-反应蛋白或降钙素原)增加或血培养阳性，这可以进一步帮助区分感染与定植。真菌感染也可以是无症状的，特别是当它是浅表感染的时候。真菌感染非常常见，全世界约有10亿人经历过真菌感染，据估计有皮肤、指甲和毛发真菌感染(主要是红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、T. interdigitale(mentagrophytes var. interdigitale)、Microsporum canis、Microsporum audouinii、Trichophyton tonsurans和Trichophyton verrucosum)，全球约有1.34亿女性患有复发性外阴阴道念珠菌病，尽管这些感染通常与死亡率无关。真菌感染导致的死亡主要发生在免疫功能低下的患者身上，约90%与真菌感染相关的死亡是由曲霉菌、隐球菌、念珠菌或肺孢子虫(Pneumocystis)，以及球孢子菌属(Coccidioides)和组织胞浆菌(Histoplasma)引起的，这些真菌甚至可以感染流行地区免疫功能低下的宿主。世界卫生组织(WHO)最近发布了一份包含19种真菌病原体的列表，这是世界卫生组织首份真菌重点病原体清单(WHO FPPL)，其中这些病原体在治疗和管理方面存在重大挑战，例如耐药性。WHO FPPL的关键优先类群包括Cryptococcus neoformans、耳念珠菌(Candida auris)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和白色念珠菌。  

某些真菌种群(包括白色念珠菌)在健康时可能会与宿主共生，但当肠道屏障功能被破坏或宿主免疫功能受损时，会入侵并感染宿主。促进感染与单一定植的真菌毒力因子包括酵母到菌丝的二态转变，以及菌丝相关的遗传程序，可以实现粘附、主动入侵、微量营养素获取(包括硫胺素、吡哆醇和烟酸)、直接宿主细胞损伤、生物膜形成和各种类型的免疫逃逸。某些分子(如蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶)的分泌促进真菌粘附和侵袭。此外，胶囊可以通过下调炎性细胞因子、消耗补体成分、抑制单核细胞抗原呈递能力、防止吞噬和促进感染来降低宿主免疫反应。另一个毒力因子是色素(如黑色素)的产生，以保护真菌免受氧化应激。此外，真菌高频抗原变异为许多真菌(包括肺孢子虫)提供了一种在适应性免疫系统攻击下生存的途径。有趣的是，一些真菌(如Rhizopus oryzae，毛霉菌病最常见病因)可以侵入血管并利用血红蛋白作为铁源。

3 真菌与细菌的关系  

抗生素可以改变肠道真菌群落，相反，抗真菌药物可以改变细菌微生物群。真菌和细菌会产生相互作用。真菌和细菌之间持续的生物相互作用或共生关系包括互惠、中性、竞争、共生和寄生。互惠是指两种微生物都从它们的关系中获益的状态，中性是指对两种微生物均无影响的，竞争是指两者都产生伤害的状态，共生是指一种微生物获益而对另一种微生物无影响的状态，寄生是指一种微生物以牺牲另一种微生物为代价获益的状态。在克罗恩病中，Candida tropicalis与Serratia marcescens和大肠杆菌(Escherichia coli)之间存在明显的共生关系，这三种细菌似乎在生物膜中相互作用，这种生物膜比单独产生的生物膜更厚。一项研究表明，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)与白色念珠菌和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)共同感染，其中鲍曼不动杆菌抑制了白色念珠菌的丝状生长并降低了其毒力。然而，白色念珠菌本身也通过群体感应分子法尼醇抑制鲍曼不动杆菌的生长。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是共生的例子，它可以进入胃中的白色念珠菌空泡并在其中存活，而对白色念珠菌没有明显益处。在白色念珠菌和艰难梭菌(Clostridium difficile)之间可以观察到寄生现象，其中白色念珠菌的存在允许艰难梭菌在(通常有毒)需氧条件下生长，而艰难梭菌通过其发酵产物对甲酚抑制菌丝和生物膜的形成，并抑制白色念珠菌的毒力。这种大量的相互作用突出了真菌和细菌之间的复杂相互作用。

4 肝胆疾病中的粪便真菌菌群  

在基本上在所有肝胆疾病中都观察到真菌菌群的变化，通常与念珠菌属和白色念珠菌的丰度增加有关。

4.1 原发性硬化性胆管炎

原发性硬化性胆管炎(PSC)的真菌菌群的特征是组成改变和α多样性增加，其中酿酒酵母减少，而Exophiala)、念珠菌属(Candida)、Humicola和Humicola griseum增加(表1，图2)。酿酒酵母具有抗炎特性，并且在炎症性肠病(IBD)发作患者中显示减少。与未感染念珠菌的PSC患者相比，患有胆道念珠菌感染(最常见的是白色念珠菌)的PSC患者具有更严重的胆管炎，其C-反应蛋白(CRP)和血清胆红素水平更高。此外，胆道念珠菌感染(55例患者中有5例可检测到)与PSC患者的生存期短有关，而胆道系统细菌感染(55例患者中有41例)不影响生存期。这表明胆道念珠菌感染与预后不良相关，这些患者可能被考虑进行肝移植。特别是，患有持续性胆管念珠菌病的PSC患者的无移植生存率显著降低，胆管癌(CCA)发病率升高，而短暂性胆管念珠菌病患者的生存率与未感染念珠菌病患者相当(见图3)。

表1 肝脏和胆道疾病中的真菌菌群变化。

图2

肝胆疾病中常见的真菌微生物组变化。念珠菌属及白色念珠菌的丰度增加与所有肝脏和胆道疾病基本相关。HBV，乙型肝炎病毒；HCV，丙型肝炎病毒。

图3

真菌导致肝胆疾病的机制。β-葡聚糖和甘露聚糖等真菌PAMPs通过各种受体诱导抗原呈递细胞，包括C型凝集素受体、toll样受体、NLRs或半乳糖凝集素3。这触发信号级联反应(如SYK-CARD9、RAF、MYD99、TRIF通路)产生细胞因子，如IL-1β、IL-6和IL-23，从而激活产生IL-17A的Th17细胞。真菌PAMPs还诱导单核细胞产生前列腺素E2，包括白色念珠菌在内的各种真菌也能产生前列腺素E2。前列腺素E2激活Th17细胞，分别通过肝星状细胞、Kupffer细胞和肝细胞促进纤维化、炎症和细胞死亡反应。它还诱导胆管细胞产生炎症反应，并产生趋化因子和细胞因子来维持和成熟Th17细胞。念珠菌分泌的毒素念珠菌溶素激活Th17细胞，损害肝细胞，并放大NLRP3炎症小体，促进炎症。β-葡聚糖还通过Kupffer细胞和巨噬细胞上的C型凝集素样受体Clec7a(=Dectin-1)诱导炎症。念珠菌激活NLRP6，加剧肝细胞癌(HCC)的发展。曲霉属分泌的黄曲霉毒素(如黄曲霉毒素B1)通过诱导DNA链断裂、氧化应激、加合物形成和基因突变导致HCC。  

4.2 原发性胆汁性胆管炎

尽管各种研究表明原发性胆汁性胆管炎(PBC)中的细菌微生物组发生了变化，包括链球菌(Streptococcus)的相对丰度增加、韦荣氏球菌属(Veillonella)和栖粪杆菌属(Faecalibacterium)减少，但迄今为止尚未对PBC患者进行粪便真菌菌群研究。有一些病例系列中PBC患者因真菌感染(肺孢子虫、毛霉菌病或与念珠菌相关的尿脓毒症)而死亡。然而，目前还没有证据表明真菌微生物组参与PBC的发病机制。

4.3 胆囊疾病

一些报告表明，念珠菌(尤其是白色念珠菌)可以从胆囊炎或胆总管梗阻患者的胆汁或胆囊组织中培养出来。这可能反映了真菌感染，因为文献中没有证据表明健康受试者体内存在真菌定植。念珠菌和白色念珠菌阳性胆汁培养物在影响胆道系统的多种疾病中具有负预后价值；尤其是念珠菌阳性的急性非结石性胆囊炎(5名ICU患者中有5名死亡)和恶性胆道梗阻(12名患者中有5人死亡)与高死亡率相关。在另一项研究中，对36名中重度急性胆囊炎患者的胆汁进行了分析，其中31名患者的胆汁中含有ITS2测序确定的细菌或真菌(6个样本中含有真菌，包括2例白色念珠菌、1例C. humilis和2例酿酒酵母，其中只有1例白色念珠菌通过培养检测到)。通过测序鉴定的106种微生物中，培养物仅鉴定出40种(38%)。胆囊切除术后患者发生胃肠道合并症(如结肠直肠癌)的风险增加。据推测，胆囊切除术可能会影响肠道微生物稳态，从而促进结直肠癌的发生和发展。事实上，与对照组相比，胆囊切除术后患者的粪便中C. glabrata和未分类曲霉菌的相对丰度增加，白色念珠菌减少。值得注意的是，接受胆囊切除术且患有癌前结肠病变(低度和高度上皮内瘤变)或结直肠癌的患者比接受胆囊切除但没有（癌前）病变的患者有更高水平的C. glabrata。有趣的是，当胆囊切除术后分析胆结石时，在色素结石和胆固醇结石中未检测到真菌DNA。

4.4 酒精相关性肝病

在调查酒精相关性肝病(ALD)患者的所有真菌生物学研究中，念珠菌和白色念珠菌都有所增加。两项ALD研究使用ITS1测序，其中一项研究发现，与对照组相比，酒精相关性肝炎(AH)和酒精使用障碍(AUD)患者的粪便中念珠菌属的比例增加，而青霉菌、酵母菌和Debaryomyces减少，而另一项研究证明，与对照组相比，AUD、AH和酒精相关性肝硬化患者粪便中念珠菌的比例较高，Epicoccum和Debaryomyces含量较低。另一项研究采用qPCR和培养方法，证明AH患者的粪便真菌负荷和白色念珠菌丰度明显高于对照组和AUD患者。根据ITS2测序结果，AUD患者的粪便中念珠菌属、Debaryomyces、毕赤酵母属(Pichia)、Kluyveromyces、Issatchenkia、Scopulariopsis、以及白色念珠菌、C. zeylanoides、Issatchenkia orientalis、Scopulariopsis cordiae的比例增加，曲霉菌属和Kazachstania humilis的相对丰度降低。有趣的是，Malasseziarestricta的存在和较高的粪便相对丰度与AUD患者更严重的肝病相关。对于AUD患者而言，仅两周的戒酒就足以改善其肝细胞坏死和凋亡标志物caspase-cleaved和完整的细胞角蛋白18(CK18-M65)水平以及每次纤维扫描的受控衰减参数(CAP)。与戒酒前相比，这与念珠菌属、马拉色菌属、毕赤酵母属、Kluyveromyces、Issatchenkia、Claviceps、Cyberlindnera和Hanseniaspora显著减少，以及白色念珠菌、C. zeylanoides、Malassezia restricta、Issatchenkia orientalis和Cyberlindnera jadinii的比例较低有关。这些发现表明，在戒酒后，真菌生态失调至少部分可逆。与对照组相比，AUD患者血清抗白色念珠菌IgG和IgM滴度显著升高，戒酒后抗白色念珠菌IgG滴度降低。

4.5 非酒精性脂肪性肝病

ITS2测序结果显示，与非酒精性脂肪肝(单纯性脂肪变性)和无/轻度纤维化的NAFLD(F0-F1)相比，更严重的非酒精脂肪性肝病(NAFLD)，即非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和具有更晚期纤维化阶段(F2-F4)的NAFLD与粪便中大量的白色念珠菌、Pichia barkeri、Mucor spp.和Cyberlindneria jadinii有关。与对照相比，这些疾病趋于严重的情况下粪便中Mucorspp./S. cerevisiae和Babjeviella inositovora/S. cerevisiae的对数比值也更高。值得注意的是，早期和晚期NAFLD之间的真菌菌群差异主要是在瘦人而非肥胖受试者中观察到的，因为当仅比较肥胖亚组时，早期和晚期NAFLD之间并没有发现显著差异。You等人的研究发现，与对照组相比，NAFLD患者粪便中Talaromyces、Paraphaeosphaeria、Lycoperton、Curvularia、Phialemoniopsis、Paraboemia、Sarcinomyces、Cladophialophora和Sordaria的相对丰度较高，而Leptophaaeria、Pseudopithyomyces和Fusicola的相对丰度降低。同一研究发现，与非酒精性脂肪肝患者相比，NASH患者的Paramycosphaerella、Fusicolla、Arthrinium、Triparticalcar、木霉属(Trichoderma)和枝孢菌属(Cladosporium)增加；NAFLD F2-F4患者与NAFLD F0-F1患者相比，枝孢菌属、Staphylotrichum、Paecilomyces和Thermomyces增加。当比较NAFLD和ALD晚期纤维化阶段的粪便真菌群落时，与ALD F3-F4患者相比，NAFLD F3-F4患者粪便中毛霉属(Mucorspp.)的比例明显高于ALD F3-F4患者，念珠菌属、白色念珠菌、Debaryomyces spp.和Blumeria spp.比例明显低于ALD F3-F4患者。除其他代谢状况外，2型糖尿病(T2DM)与NAFLD相关。与无T2DM的NAFLD患者相比，患有T2DM的NAFLD患者的白色念珠菌、Pichia barkeri、Malassezia spp.有所增加，而Kazachstania spp.和Blumeriaspp.有所减少。与对照组相比，发现患有T2DM的病人的粪便中念珠菌属、Cladosporium、Kodamaea、Meyerozyma、Mortierella和Malessezia furfur的比例更高，而粪便中Issatchenki、Macrophomina、Marasmius、Gymnopilus、Saccharomyces、Trichoderma、Cochliobolus、Psathyrella和Clavispora的比例较低。

4.6 病毒性肝炎

与对照组相比，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染患者表现出真菌产物向血清中的易位增加，真菌β-葡聚糖血清水平升高证明了这一点。慢性HBV肝炎或HBV肝硬化患者更容易在粪便中检测出C. parapsilosis、C. glabrata、C. krusei、C. tropicalis和酿酒酵母阳性，与对照组相比，他们粪便中的白色念珠菌、C. albicans、C. parapsilosis、C. krusei和酿酒酵母的DNA水平也更高。Chen等人研究发现，与对照组相比，HBV感染和HBV相关肝病患者粪便中的曲霉菌属(包括A. versicolor)、念珠菌(包括白色念珠菌和热带念珠菌)、酵母菌(包括酿酒酵母)和Simplicillium spp.的阳性率更高。使用培养方法，与对照组相比，慢性乙型肝炎患者(包括相关肝硬化患者)的粪便中检测到更多酵母菌CFUs。慢性HCV感染患者(包括肝硬化患者)粪便真菌负荷明显高于对照组，念珠菌检测阳性的频率更高。

4.7 肝硬化

众所周知，肝硬化患者存在严重的细菌微生物群失调。与对照组相比，不同病因继发肝硬化患者粪便细菌和真菌Shannon多样性指数较低，这些指数与终末期肝病模型(MELD)评分间接相关。需要住院治疗的肝硬化患者粪便中念珠菌的相对丰度也高于没有门诊肝硬化患者或对照组。另一项研究使用了qPCR和培养技术，结果显示与对照组相比，肝硬化患者十二指肠液样本中念珠菌的检出率更高(qPCR 81.5% vs 61.5%，培养66.7% vs 46.2%)，尽管这些结果没有达到统计学意义。念珠菌粘膜感染发生在肝硬化阶段，并与疾病严重程度相关：2762例肝硬化患者中有100人被诊断为食管念珠菌病，与无食管念珠菌病的肝硬化患者相比，食管念珠菌病患者的MELD评分更高(12.4 vs 11.2，p=0.007)，急性慢性肝衰竭(ACLF)发生率更高(26% vs 10%，p=0.003)。肝硬化患者中发生的真菌感染，主要由念珠菌引起，与无感染或有细菌感染的肝硬化患者相比，通常与诊断延迟、ACLF发生率高、住院时间长、重症监护室入院率高以及30天生存率差有关。大多数真菌感染的病死率为30%，但真菌血症和真菌性腹膜炎的病死率超过50%。同样，与肝移植相关的细菌和真菌感染也很常见，超过一半的患者主要由于复杂的手术过程而发生，侵袭性真菌感染与25%-67%的高死亡率有关。

4.8 肝细胞癌

黄曲霉毒素是曲霉属(包括黄曲霉和寄生曲霉)产生的食物污染物，是已知的人类致癌物，已被证明是肝细胞癌(HCC)发病机制中的病原体。黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知最有效的肝癌致癌物。在一项病例对照研究中，348名新诊断为HCC的中国患者和597名无肝病的对照组相比，HCC患者的AFB1暴露量高于对照组(暴露年限和暴露水平的比值比[OR]分别为6.49和6.75)。AFB1相关的HCC主要常见于东南亚和撒哈拉以南非洲，尽管在美国南部的HCC患者中也偶尔检测到AFB1 DNA加合物升高的现象。此外，遗传易感性也可能在AFB1相关的HCC中发挥作用。在X射线修复交叉互补基因7(XRCC7)中具有rs#7003908G等位基因(XRCC7-TG/-GG)的个体患AFB1相关HCC的风险显著高于rs#70039008T纯合子(XRCC7-TT)([OR]分别为3.45和5.04)。

尽管肝硬化患者的粪便中念珠菌水平已经升高，但发现HCC患者的粪便念珠菌和白色念珠菌的比例甚至高于肝硬化患者，但Kazachstania、Debarymyces、Xerodomyces、Amorpotheca和Blastobottrys的比例更低。在HCC小鼠模型中，用白色念珠菌灌胃导致HCC体积增加，这取决于核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白6(Nlrp6)炎性小体。此外，肝硬化患者HCC的发展会增加他们患食管念珠菌病的风险，OR值为10.04。

4.9 肝胆疾病对真菌抗原的免疫反应

4.9.1 抗酿酒酵母抗体(ASCA)

ASCA检测到酿酒酵母甘露聚糖，这是一种常见于大多数真菌的细胞壁碳水化合物。ASCA还与来自其他真菌物种的甘露聚糖发生交叉反应，包括S. boulardii、S. pastorianus、Schizosaccharomyces pombe、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和白色念珠菌。这里需要特别强调的是，白色念珠菌是已知的ASCA形成的强免疫原。PSC、抗线粒体抗体(AMA)阴性PBC和AMA阳性PBC患者的ASCA患病率(分别为44%、53%和18%)高于献血者(5%)，尽管ASCA的存在与任何临床或生化参数无关。与对照组相比，上述条件下ASCA IgA和IgG阳性率均较高。在PBC中，ASCA滴度与循环IgA水平升高相关，这可能是粘膜免疫增强的间接标志。酒精相关性肝硬化患者血清ASCA-IgG滴度高于对照组和HBV肝硬化患者。较高的ASCA-IgG滴度与酒精相关性肝硬化患者的5年生存率降低相关。AH患者的血清ASCA-IgG水平也高于AUD患者或对照组。此外，ASCA-IgG滴度的增加预示着AH患者90天和180天生存期的恶化。由ASCA-IgG滴度和MELD评分组成的模型对死亡率的诊断性能明显优于单独的MELD评分。

4.9.2 特异性抗白色念珠菌抗体

与对照组相比，AUD患者的特异性血清抗白色念珠菌白IgG和IgM滴度升高，有趣的是，戒酒后，AUD患者的抗白色念珠菌IgG滴度(而非IgM滴度)显著下降。这些变化与AUD患者粪便中白色念珠菌比例的升高(与对照组相比)相一致，在戒酒后，白色念珠菌比例降低。类似地，NAFLD和晚期纤维化患者(F3-F4)与NAFLD患者和无/早期纤维化患者(F0-F2)以及对照组受试者相比，血浆抗白色念珠菌IgG滴度升高。白色念珠菌IgG滴度与粪便白色念珠菌/酿酒酵母的对数比相关。因此，抗白色念珠菌IgG滴度与ALD和NAFLD的疾病活动性相关，表明在更严重的肝病中，白色念珠菌的全身暴露更多。

4.10 对念珠菌溶素的免疫反应

念珠菌溶素是白色念珠菌分泌的溶细胞肽毒素，它直接损害上皮膜，触发危险反应信号通路，并激活上皮免疫。缺乏这种毒素的白色念珠菌菌株不会激活或损伤上皮细胞，在粘膜感染的动物模型中是无毒的。与AUD患者相比，AH患者粪便中编码念珠菌溶素的细胞伸长1(ECE1)基因的频率更高。此外，在为期两周的乙醇暴食模型中，灌胃野生型ECE1阳性白色念珠菌的小鼠血清ALT水平、肝脏甘油三酯和炎症显著高于灌胃ECE1阴性白色念珠菌的小鼠，这个结果支持ECE1阳性白色念珠菌会加重小鼠乙醇诱导的脂肪性肝炎的观点。同样，ECE1/念珠菌溶素阳性AH患者的MELD评分明显高于ECE1阴性AH患者，90天死亡率也更高。分泌性IgA在肠道屏障保护中发挥重要作用，白色念珠菌诱导的分泌性IgA优先结合白色念珠菌菌丝(与毒力相关的真菌形态类型)，而不是其酵母形态类型。它还结合ECE1衍生的念珠菌溶素，克罗恩病患者中念珠菌溶素的结合较少，表明出现真菌相关的免疫失调。这种异常的免疫反应也可能在ALD中起作用。

5 真菌导致肝胆疾病的机制  

抗真菌治疗可改善多种小鼠模型的肝病，包括乙醇和西方饮食诱导的脂肪性肝炎。此外，白色念珠菌或限制性马拉色菌(Malassezia restricta)的定植会加重肝病。因此，真菌及其产物会导致肝病。下文将讨论真菌促进肝病发展和进展的可能机制。

5.1 免疫系统识别真菌并产生免疫反应的途径

免疫细胞上的模式识别受体(PRRs)可以感应真菌中的病原体相关分子模式(PAMPs)并启动免疫反应。受体组包括C型凝集素受体(Clrs)，其中有甘露糖受体、CLEC7a (=Dectin-1)、CLEC4n (=Dectin-2)、Mincle、DC-SIGN；toll样受体(TLRs)，包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR9；核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs)，其中有NLRP3、NLRP4、NLRP6、NLRP10、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(NOD1)和2(NOD2)；以及半乳糖凝集素3。一旦这些受体识别真菌，它们就会触发信号级联(如SYK-CARD9、RAF、MYD99、TRIF通路)，产生细胞因子，如白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-12、IL-23、转化生长因子-β和干扰素-γ，从而诱导产生IL-17A的T辅助细胞17(Th17)和Th1细胞。这种炎症反应可导致肝胆疾病。

5.2 β-葡聚糖

长期饮酒会增加小鼠体内真菌菌群和真菌β-葡聚糖向全身循环的易位。口服抗真菌两性霉素B可减少粪便真菌过度生长和β-葡聚糖易位。口服两性霉素B或卡泊芬净的抗真菌治疗可在不改变血浆细菌LPS水平的情况下预防小鼠乙醇诱导的肝病。同样，在乙醇诱导和西方饮食诱导的脂肪性肝炎小鼠模型中，用抗真菌药物治疗后，粪便中细菌亚群的丰度没有变化。β-葡聚糖通过Kupffer细胞上的CLEC7a诱导肝脏炎症，如骨髓嵌合小鼠的实验所示。CLEC7a依赖性地通过NLRP3激活caspase-1，导致炎症性IL-1β表达和分泌增加，进而导致肝细胞损伤和乙醇诱导的肝病。CLEC7a也在饮食诱导的脂肪性肝炎中发挥作用，因为其在NASH患者和高脂肪饮食小鼠中的肝脏表达显著增加，而Clec7a缺陷小鼠和用Clec7a拮抗剂治疗的小鼠可免受饮食诱导的脂性肝炎和纤维化的影响。

5.3 念珠菌溶素

腹腔注射感染白色念珠菌的大鼠出现肝脏脂肪变性、血清ALT水平升高、炎症标志物和明显的脂质过氧化。这些证据提出了白色念珠菌如何引起肝病的问题。一种效应可能是其分泌的溶细胞毒素，即念珠菌溶素。念珠菌溶素会加重乙醇诱发的肝病，并与小鼠死亡率增加相关。念珠菌溶素独立于Clec7a作用于骨髓来源细胞，因为与灌胃念珠菌溶素阴性白色念珠菌的相同嵌合体小鼠相比，用Clec7a缺陷小鼠的骨髓来源细胞移植并随后灌胃野生型念珠菌溶素阳性白色念珠菌的小鼠中血清ALT水平、肝脏甘油三酯和炎症显著升高。在体外，念珠菌溶素可以通过剂量依赖性方式损伤原代肝细胞，并与AH患者的肝病严重程度和死亡率相关。白色念珠菌是人类Th17细胞抗真菌反应的主要真菌诱导物。Th17细胞似乎在PSC中发挥作用，因为白色念珠菌刺激外周血单个核细胞(PBMCs)导致PSC-PBMCs中Th17细胞的比率显著高于健康对照组的PBMCs。在溃疡性结肠炎患者中发现了具有高免疫细胞损伤能力的白色念珠菌菌株(HD菌株)，这些HD菌株通过IL-1β依赖机制加重体内肠道炎症。肠道中HD菌株的Th17细胞抗真菌反应依赖于念珠菌溶素。虽然在上述小鼠乙醇诱导的肝病模型中，念珠菌溶素没有改变肠道屏障功能，但类似的机制也可能导致肝病。念珠菌溶素激活NLRP3炎性小体。已知NLRP3炎性小体在NAFLD/NASH的发展中发挥核心作用。因此，有理由假设念珠菌溶素也参与了NAFLD/NASH的发病机制。同样，在小鼠模型中，白色念珠菌诱导的HCC恶化被证明是NLRP6炎性小体依赖性的。

5.4 前列腺素

已知前列腺素在肝病中起作用。特别是前列腺素E2(PGE2)在炎症过程中起着关键作用。与对照组相比，人NASH肝脏中PGE2合成关键酶环氧化酶2和微粒体PGE合成酶1(mPGES-1)的表达增加，并与NAFLD活性评分相关。PGE2在肝硬化和终末期肝病急性失代偿患者中驱动免疫抑制，部分通过抑制巨噬细胞细胞因子分泌和细菌杀伤，使得疾病进一步恶化。还有研究发现真菌参与了致病过程。乙醇诱导的脂肪性肝炎小鼠体内产生PGE2的真菌Meyerozyma guilliermondii增加。此外，在两性霉素处理的小鼠中，补充Meyerozyma guilliermondii会增加PGE2的产生，从而加重乙醇诱导的肝病；在该小鼠模型中同时给予COX2抑制剂吲哚美辛可缓解肝病。同时服用抗真菌药也可消除PGE2的形成和乙醇诱导的肝病。此外，白色念珠菌是通过PGE2的Th17应答的有效诱导物；PGE2由白色念珠菌组分甘露聚糖和β-葡聚糖诱导，甘露聚糖和葡聚糖分别被甘露糖受体和Clec7a/Tlr2途径识别。已知Th17细胞分别通过Kupffer细胞和肝星状细胞诱导炎症和纤维化，并通过IL-17损伤肝细胞，从而恶化肝脏疾病。Th17细胞也会加重PBC中的胆道炎症。此外，白色念珠菌已经进化出从花生四烯酸产生PGE2的能力，以促进其自身在宿主肠道中的定植。缺乏PGE2产生的白色念珠菌突变体(基因上缺少ole2，一种脂肪酸去饱和酶)不能在小鼠胃肠道中定植，这可以通过补充PGE2来改善。然而，白色念珠菌突变体不会影响系统性念珠菌病小鼠模型的存活率，也不会改变口咽和外阴阴道念珠菌病小鼠的舌头或阴道组织感染。

5.5 黄曲霉毒素

黄曲霉毒素主要由曲霉属真菌产生，通过诱导DNA链断裂、氧化应激、加合物形成和基因突变导致HCC的发生。AFB1诱导持续的单链和双链DNA断裂，从而诱导氧化应激和脂质过氧化。AFB1与DNA相互作用并形成DNA加合物，如2,3-dihydro-2-(N7-guanyl)-3-hydroxy-aflatoxin B1。AFB1-DNA加合物与血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5)的表达和多态性呈负相关，ADAMTS5是抑制肿瘤血管生成和转移的肿瘤抑制基因。ADAMTS5蛋白的缺失与HCC的进展和不良预后相关。AFB1的代谢活性形式可导致基因突变，其倾向于GC而非TA突变。类似地，众所周知，AFB1诱导p53抑癌基因密码子249中G->T的突变，这被认为是AFB1引起的HCC的分子标记物。AFB1还通过激活致癌基因(包括N-ras、c-Ha-ras和c-Myc)促进HCC的形成。HBV和AFB1暴露对HCC的发展有协同作用。HBV感染单独导致HCC发生的相对风险为7.3，AFB1暴露单独导致HCC发生的相对风险为3.4，HBV和AFB1联合导致HCC发生的相对风险为59.4。这是由于几个机制：慢性HBV感染诱导细胞色素P450s将无活性的AFB1代谢为致突变的AFB1-8,9-环氧化物；慢性HBV诱导肝细胞坏死并增加活性氧和氮物种水平，增加AFB1诱导的p53 249ser突变的可能性；而去除AFB1-DNA加合物的核切除修复被HBV X蛋白抑制。另一种天然存在的真菌毒素是由轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)产生的伏马菌素B1，已有研究表明其可诱导具有恶性潜能的肝细胞和胆管细胞肿瘤。

6 肝胆疾病中真菌菌群的治疗调节  

在肝胆疾病的各种实验模型中，肠道真菌群落的操纵显示出了治疗希望。尽管抗真菌治疗本身会导致严重的肝毒性，甚至可能导致死亡，但各种啮齿类动物的研究表明，口服抗真菌药物两性霉素和卡泊芬净可以改善乙醇诱导的肝病或饮食诱导的脂肪性肝炎。尽管用白色念珠菌或Meyerozyma guilliermondii会加剧实验性乙醇诱导的肝损伤，但用其他真菌进行干预可以改善各种实验性肝病。S. boulardii是研究最多的酵母益生菌。补充S. boulardii可以改善实验性急性肝损伤的形式：它可以减轻克拉霉素和甲氨蝶呤诱导的肝脂质过氧化和抗氧化剂谷胱甘肽的消耗。S. boulardii还改善了D-半乳糖胺诱导的小鼠肝损伤，降低肝脏转氨酶水平，并减轻了肝细胞坏死、出血和组织学炎症浸润。补充S. boulardii可进一步改善实验性代谢性肝病：它可减轻db/db小鼠的肝脏脂肪变性、炎症以及脂肪质量；链脲佐菌素糖尿病小鼠的高血糖、血脂异常和肝脏炎症；以及蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的脂肪性肝炎小鼠的肝损伤、炎症、脂肪变性和纤维化。此外，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化实验模型中，S. boulardii可改善肝纤维化、炎症、损伤(按转氨酶水平计算)、脂质过氧化、肠通透性和血浆LPS水平。即使在大鼠胆管结扎引起的梗阻性黄疸模型中，S. boulardii也能减少细菌向血液、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏的易位，尽管它不能改善生化胆汁淤积和肝损伤标志物。然而，在一项涉及18名肝硬化患者的小型试验中，在30天内每天三次口服补充1×109个S. boulardii细胞并没有改善肠道通透性。施用酿酒酵母可减轻AFB1对仔猪的肝脏毒性，导致肝脏转氨酶和肝脏AFB1浓度显著降低，并可防止黄曲霉毒素中毒的组织学特征。然而，我们还必须考虑真菌益生菌给药的风险，因为它可能与显著的死亡率和发病率相关，特别是在免疫抑制或危重症患者中，如一系列医源性酿酒酵母真菌血症病例所显示的那样。尽管在肠道疾病(如肠易激综合征或炎症性肠病)的多个临床试验中发现真菌益生菌给药有益，但肝胆疾病中仍然缺乏稳定可靠的临床前证据。因此，需要更多的人体试验来评估真菌益生菌在肝胆疾病中的价值。

结论

真菌菌群的变化现已经基本上在所有肝胆疾病中得到证实。然而，它们仍然是一种暗物质，因为我们常常不知道它们的真实身份和特征，并且这些真菌中的许多菌种我们无法对其培养。此外，目前的方法往往对最流行的真菌种群或某些亚种群有一些偏见，这可能会妨碍对依赖不同方法的研究进行直接比较。此外，它们不容易在小鼠中定植，因此当前我们还没有好的小鼠模型。尽管如此，我们知道一些真菌本身具有肝毒性，而不仅仅是旁观者，例如，被白色念珠菌感染的啮齿动物在没有额外刺激的情况下会患上肝脏疾病。因此，真菌可能会在两种模式下加重肝病，一种是酒精、西式饮食或毒素，另一种是真菌的存在和有害影响。我们正在越来越多地了解真菌导致肝病的机制，无论是通过真菌细胞壁成分还是分泌的毒素，如β-葡聚糖或念珠菌溶素，还是包括前列腺素在内的真菌代谢产物。这些知识将帮助我们开发创新和个性化的疗法，以更好地治疗这些疾病。