人肾结石中钙结合蛋白的多色成像，用于阐明蛋白质对晶体生长的影响

Tanaka Y, Maruyama M, Okada A, Furukawa Y, Momma K, Sugiura Y, Tajiri R, Sawada KP, Tanaka S, Takano K, Taguchi K, Hamamoto S, Ando R, Tsukamoto K, Yoshimura M, Mori Y, Yasui T. Multicolor imaging of calcium-binding proteins in human kidney stones for elucidating the effects of proteins on crystal growth. Sci Rep. 2021 Aug 26;11(1):16841. doi: 10.1038/s41598-021-95782-1. PMID: 34446727; PMCID: PMC8390759.

肾结石形成的发病机制包括涉及矿物成分和蛋白质基质之间复杂相互作用的多步骤过程。肾结石中的钙结合蛋白对结石的形成有很大的影响。这些蛋白质在肾结石中的空间分布对于评估蛋白质对结石形成的体内影响至关重要，尽管这些蛋白质的实际分布尚不清楚。我们揭示了三种不同蛋白质的微观分布，即骨桥蛋白（OPN），肾凝血酶原片段1（RPTF-1）和钙粒蛋白A（Cal-A），在保留原始矿物相和质地的人肾结石中：草酸钙一水合物（COM）和草酸钙二水合物（COD）。OPN和RPTF-1分布在COM和COD晶体内部，而Cal-A分布在晶体外部。OPN和RPTF-1在具有镶嵌纹理的COM晶体中表现出均匀分布，并且在COD晶体中呈周期性分布平行于特定晶面。这些蛋白质的独特分布使我们能够根据每种蛋白质的物理化学性质和每种蛋白质的复杂物理环境变化来解释每种蛋白质对CaOx晶体生长的不同体内影响。这种方法将进一步使我们能够阐明不同蛋白质对肾结石形成的体内影响。

肾结石病是一种常见的疾病，一生中至少影响一次1.7-14.8%的人口1,2.在多达 50% 的病例中，这种疾病在第一次发作后 5 年内复发。尽管这个健康问题很重要，但无法对结石形成进行预防性治疗。了解肾结石形成的发病机制对于减少肾结石疾病的发生和复发至关重要3.大约 80% 的肾结石是草酸钙 （CaOx） 结石4,5.CaOx结石由~90%的矿物相组成，即CaOx，进一步分为草酸钙一水合物[Ca（C2O4)·H2O]（COM）和草酸钙二水合物[Ca（C2O4）·2H2O]（COD），以及相对较少的有机物，其被视为蛋白质基质6.肾结石形成的发病机制包括涉及矿物质成分和蛋白质基质之间复杂相互作用的多步骤过程7,8.

在肾结石中鉴定出100多种蛋白质9–11.其中，已知几种蛋白质，特别是钙结合蛋白，在CaOx结石形成过程中起着至关重要的作用12–16.这些蛋白质的具体作用已经在结石形成的许多步骤中进行了深入研究，包括晶体成核、晶体生长、晶体聚集和晶体粘附，并进行了许多体外结晶研究17–19.体外研究有助于评估特定蛋白质对结石形成中特定步骤的影响。然而，在真实的结石形成环境中，蛋白质的数量同时起作用，并且蛋白质、钙离子和草酸盐浓度的尿液成分波动。这种担忧促使我们研究真正的人类肾结石，以发现蛋白质对晶体生长的真正影响。

在以前的大多数研究中，肾结石中蛋白质的鉴定都是在粉碎和提取后用质谱法进行的9–11.因此，有关结石中蛋白质空间分布的信息丢失。在非常有限的研究中，肾结石中的蛋白质鉴定已经通过肾结石切片进行，其中CaOx晶体通过脱钙完全去除20,21.这种方法有助于发现肾结石中蛋白质的分布，这可能有助于了解蛋白质对结石形成的特定影响。然而，这种方法丢失了大量记录在肾结石晶体中的结石形成信息。70多年的先前研究表明，肾结石的矿物信息的重要性可以通过鉴定晶相以及使用光学显微镜对肾结石的切片和抛光薄片进行晶体纹理分类来获得。22,23.

缺乏评估肾结石中原始CaOx晶体蛋白质分布的分析一直是理解结石形成的一个相当大的障碍。蛋白质分布和晶相/形态的协调评估可以提供有关结石形成历史的重要信息。多重免疫荧光染色（multi-IF染色）已被用于显示两种或多种蛋白质在生物样品的许多类型的软组织中的分布24.该技术在由多孔磷酸钙晶体组成的骨组织中的应用也为骨矿物质稳态的动态调节提供了重要的见解25.然而，这尚未用于研究由致密和坚硬晶体组成的肾结石，尽管单次免疫荧光染色已用于显示脱钙肾结石中特定蛋白质的分布，该蛋白质不会保留矿物质信息20,21.本研究调查了能够对保留原始矿物质信息的肾结石样本进行多中频染色的条件。我们研究了三种不同蛋白质，骨桥蛋白（OPN），肾凝血酶原片段1（RPTF-1）和钙粒蛋白A（Cal-A）在CaOx结石薄片中的分布。这些蛋白质在大多数CaOx结石中很常见，被称为钙结合蛋白，可能影响CaOx结石的形成26–28.据我们所知，这是第一个在肾结石中共同可视化多种基质蛋白的研究。我们根据每种蛋白质的分布、理化性质以及CaOx结石形成过程中每种蛋白质的复杂物理环境变化，进一步解释了每种蛋白质对CaOx晶体生长的不同体内影响。

基于显微镜观察和FT-IR分析，将肾结石样品的结构域分为三种类型的纹理，这些纹理与舒伯特和Brien报道的纹理一致。23：由正面体COD晶体组成的不规则纹理（类型1，称为正面体COD聚集体;无花果。1c）、由不规则取向COM晶体组成的镶嵌纹理（2型，简称马赛克COM;无花果。1f）和同心层压COM晶体（3型，称为同心COM;无花果。1大多数观察到的CaOx结石样品由这三种纹理组成（表）。（表11).

图1本研究中分析的肾结石样本。

（a）样本1。

（b）样品1薄片的偏振显微镜图像。

（c）（b）中白框区域的放大图像。

（d）样本2。

（e）样品2薄片的偏振显微镜图像。

（f）（e）中白框区域的放大图像。

（g）样本3。

（h）样品3薄片的偏振显微镜图像。

（i）中白框区域的放大图像。

将用于生物样品的多IF染色方案应用于分析通过典型地质方法制备的肾结石样品的薄片。对于该应用，调整染色前薄切片的蚀刻条件，发现只有在典型染色过程之前对抛光的薄切片进行轻微蚀刻（用pH 6.0柠檬酸盐溶液1分钟）时，可视化才成功。多IF染色能够对三种不同宝石纹理中不同颜色的三种蛋白质（OPN：绿色，RPTF-1：蓝色和Cal-A：红色）进行共可视化。

我们发现每种蛋白质都表现出特征分布模式，具体取决于其在COM和COD中的位置。在7个样品中的15个样品中发现了正面体COD聚集体（表）（表1）。1).正面体COD聚集体主要存在于CaOx肾结石的外围（图）。（图 1a–c）。1a-c）。已知这些COD晶体具有由{101}面组成的四方双锥体形状29.许多COD双金字塔的两座金字塔的顶端也有{110}面（图）。2b 和补充图。S1).COD晶体的多IF染色图像如图所示。2a，OPN周期性地出现在COD的表面{110}如图中的白色箭头所示。2c.这张脸与典型的COD体外晶体生长中没有出现的双锥尖的面相同。29.RPTF-1沿{101}面显示为平行层，具有μm尺度的间隔，如图中的黄色箭头所示。2这种晶面是典型COD生长的特征。29.Cal-A存在于COD晶体之外，在特定表面上没有显示出优先吸附（图）。2在其他结石样品中也观察到相同的分布模式（补充图）。S2).

图2正面体COD聚集体中的蛋白质分布。

（a）多中频图像。白框区域的放大图像如（b）–（e）所示。

（b） 光学图像。水晶面用黄色虚线和这些索引显示。

（c） OPN的IF图像。晶体面和层流层分别用黄色虚线和白色箭头显示。

（d） RPTF-1的中频图像。晶体面和层流层分别用黄色虚线和黄色箭头显示。

（e） 卡尔-A的中频图像。水晶面和层状层用黄色虚线显示。

马赛克COM纹理是CaOx石头中最普遍的纹理（图。（图 1d–f）。1d-f）。在12个样品中的15个样本中观察到这种纹理（表）（表1）。1).马赛克COM的多IF染色如图所示。图3a，b.3a，b. OPN和RPTF-1存在于COM晶体中（图）。（图 3c，d）。3c，d）。相反，Cal-A仅沿晶界（即，在COM晶粒的表面上）存在（图）。3我们进一步分析了蛋白质的线强度曲线，如图所示。3a，详细评估每种蛋白质的分布模式（图上的黄线）。4OPN和RPTF-1在晶体区域显示出较高的强度，而Cal-A在晶体区域的强度较低（图）。4b）. Cal-A的高强度仅沿晶体边界观察到。尽管COM颗粒的大小和形状不同，但在许多样品中都可以看到这些蛋白质分布（补充图）。S3).

图3马赛克COM中的蛋白质分布。

（a）多中频图像。白框区域的放大图像如（b）–（e）所示。

（b） 光学图像。晶界用黄色虚线显示。

（c） OPN的IF图像。晶界用黄色虚线显示。

（d） RPTF-1的中频图像。晶界用黄色虚线显示。

（e） 中频图像。晶界用黄色虚线显示。

图4COM样品中蛋白质IF染色的线强度曲线。

（a） 带有黄色箭头显示的线轮廓轨迹的马赛克 COM 颗粒。

（b）（a） 中贯穿马赛克 COM 颗粒的线强度剖面。

（c） 锥形层压COM纹理，带有黄色箭头显示的线轮廓轨迹。

（d）（c） 中横跨锥形层压 COM 晶粒的线强度剖面。

同心COM也是CaOx石头中的典型纹理（图）。（图1g–i）。1G-I）。我们在 10 个样本中的 15 个样本中发现了这种纹理（表（表1）。1).OPN、RPTF-1和Cal-A分布在同心层中（图）。5OPN和RPTF-1作为恒定层和规则层存在于COM晶体中，形成微米级间隔（图）。（图5b，c）。5b，c）。相比之下，Cal-A分布由位于石头外表面的不规则且间隔相对较宽的层组成（图）。5SEM观察显示每个Cal-A层附近有一个间隙层（图）。（图 6a，b）。6a，b）。产生间隙空间的两个表面都被微小的沉积物占据，这些沉积物与构成同心COM的主要COM晶体明显不同（图）。（图 6c，d）。6c，d）。这些蛋白质在同心COM中的线强度曲线显示每个蛋白质谱中的峰值（图）。（图 4c，d）。4c，d）。OPN和RPTF-1的分布相似（即5.58±2.70μm/层OPN和5.99±2.56μm/层的RPTF-1）（补充表S1).然而，Cal-A层的间隔明显大于OPN和RPTF-23（即17.18±57.1μm/层）。在其他9个样品中的大多数中都观察到类似的分布模式和间隔，尽管在少数样品中没有看到Cal-A层（补充图）。S4和表S1).

图5圆锥层压COM中的蛋白质分布。

（a）多IF图像。

（b） OPN的IF图像。

（c） RPTF-1的中频图像。

（d） 卡尔-A的中频图像。

图6

（a）薄切片的扫描电子显微镜（SEM）图像。

（b） 多中频染色和薄片SEM的合并图像。SEM图像中显示的同心对齐间隙空间的位置与Cal-A层压的位置重叠。

（c） 坠毁同心通信的 SEM 图像。

（d）（c）（c） 中白框区域的放大图像。

同心COM石从中心到外部的方向用白色虚线箭头显示。COM晶体之间的间隙空间用白色实心箭头表示。

本研究显示，CaOx结石中3种质构的比例及3种质地中3种蛋白质的分布与结石前者的年龄、性别无明显关系，但所研究结石的量不足以进行相关性分析。

根据电解从石粉提取物中检测到的 OPN、RPTF-1 和 Cal-A 已知存在于 CaOx 结石中9–11.免疫细胞化学技术脱钙CaOx结石中OPN的微观分布显示，OPN在CaOx结石的同心片中分布21,30.本方法生动地可视化了三种不同蛋白质在先前认为的“有机层”中的位置（图）。7a，b）。我们在同心COM中研究中显示的OPN分布模式与先前的观察结果一致。进一步发现，RPTF-1在同心COM中的分布模式与OPN几乎相同，而RPTF-1在COD晶体中的分布与OPN的分布不同。相反，Cal-A的分布模式与其他两种蛋白质完全不同。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的这些不同微观分布记录了 CaOx 结石形成的历史。

图7CaOx中三种主要质构中的蛋白质分布示意图。

（a） 以前研究中考虑的蛋白质基质分布（白色：矿物相黑色：有机物）。

（b）本研究中发现的特定蛋白质分布（绿色：骨桥蛋白（OPN），蓝色：肾凝血酶原片段1（RPTF-1）和红色：钙粒蛋白A（Cal-A）。类型 1 特异型 COD、类型 2 马赛克 COM 和类型 3 同心层压 COM。

讨论

蛋白质掺入晶体的主要控制因素

OPN和RPTF-1均存在于正面体COD晶体、镶嵌COM晶粒和同心COM中（图）。（图2a，2一个a，3a3a 和和5a）。5这一发现证实了这些蛋白质同时掺入COD和COM晶体中。Cal-A存在于正面体COD晶体的外部和马赛克COM颗粒周围（图。（图2e2e 和和 3e）。3在同心COM的情况下，通常在Cal-A层周围发现的间隙空间表明Cal-A层不包含在晶体中，而是分布在晶体的表面上（图）。（图5d5d 和和6a-d）。6A–d）。这些分布表明OPN和RPTF-1倾向于掺入CaOx晶体中，而Cal-A几乎没有掺入。

蛋白质吸附和掺入CaOx晶体理论上受到其氨基酸侧链的结合力和各自蛋白质的其他特定性质（如静电负电荷）的影响31,32.净电荷表明OPN和RPTF-1比Cal-A带更多的负电荷，OPN，RPTF-1和Cal-A的等电点分别为3.5，2.5-3.0和6.5-7.033–35.已知OPN，RPTF-1和Cal-A具有钙结合结构域36–38.这些结构域还可以作为生长晶体表面的局部结合位点。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的钙结合域可分别结合 10、7 和 2 个钙离子36–38.因此，这些蛋白质对CaOx表面带正电荷的Ca的体积和局部亲和力会导致这些蛋白质在CaOx中的掺入效率不同。

晶体生长通过将生长单元合并到晶体表面上出现的步骤和扭结位点来进行39,40.蛋白质和生长晶体表面之间的三维相容性将决定蛋白质掺入晶体表面的程度。与生长扭结位点和步骤具有强结合能力的蛋白质倾向于更有效地结合到生长晶体中41–43.目前报道的三种蛋白质的分布和钙亲和力表明，OPN和RPTF-1的强亲和力有助于结合并掺入COD和COM晶体。相反，具有较低亲和力的Cal-A仅粘附在晶体表面，而不掺入晶体中。之前的一项研究表明，更多的磷酸化肽将肽掺入COM的比率更高，这支持了这一解释。43.这些讨论将使我们能够根据其钙结合特性预测许多其他蛋白质的分布。

OPN和RPTF-1对CaOx晶体生长的体内选择性吸收及抑制作用

主要存在于CaOx石外围的正面体COD晶体被认为具有特征性的层状纹理，其中所谓的“有机物层”和“矿物层”在晶体生长过程中相互交替生长44,45.虽然层移的确切原因尚不清楚，但可能的解释包括人类宿主的环境变化，肾脏生理和尿液生化变化，以及形成矿物中发现的振荡分区结构的动力学反馈机制。

8.结果表明，OPN和RPTF-1分别构建了对应于COD面{110}和{101}的层叠织构作为晶内蛋白，而Cal-A不包含在层压织构中（图）。（图 2c–e）。2c-e）。这种蛋白质在肾结石晶体上/肾结石晶体中表面选择性吸附/掺入的体内证据表明，蛋白质的分布与光学显微镜观察到的传统“有机物层”不同（图）。7Chien等人（2009年和2018年）报道了OPN在COD晶体上选择性吸附的体外证据。46,47.根据这些报告，OPN与COD的典型晶体{110}面结合并掺入矿物相中，与我们的结果一致（图）。7表面选择性吸附/掺入可能是由于每种蛋白质的钙结合能力和/或蛋白质分子上官能团之间的不同分子相容性以及每个晶体表面上晶格离子的排列引起的。

据报道，大多数蛋白质在结石形成过程中抑制CaOx晶体生长48,49.肽对晶体生长的抑制被认为是通过步骤销和/或扭结阻断41–43.在以前的体外研究中，OPN和RPTF-1已知是CaOx晶体生长的抑制剂48,49.然而，肾结石形成的抑制程度尚不清楚。

目前的观察表明，大多数肾结石COD晶体具有典型的晶体习性，面{101}（图）。2生长速度相对缓慢的晶体表面通常发育良好。40.这一发现表明，与其他表面（例如{101}）相比，COD{110}面的生长速度较慢。RPTF-1的优先吸附通过掺入COD而可能减缓晶体生长，与{101}面一起被发现为层压结构（图）。2另一方面，我们发现COD晶体内部{110}面作为OPN层叠结构（图）。2c）. 与体外研究获得的无OPNCOD晶体的{110}面相比，OPN层叠结构的{110}面更发达。46.优先吸附OPN的COD的{110}面不是典型晶体习性COD上出现的晶面47.因此，OPN对{110}的吸收会极大地减缓相对表面生长速率，并且减速速度足够慢，可以出现{110}面。换句话说，{110}面的出现改变了许多肾结石样本中的一般晶体习性。

COM晶体表现为马赛克纹理或同心纹理（图。（图 3a3a 和和5a）。5OPN和RPTF-1均均匀地存在于马赛克纹理的COM颗粒中（图）。（图 3c，d）。3c，d）。因此，这些蛋白质对这种类型的COM的生长速率的影响尚不清楚。在同心 COM 中，板条状晶体从中心向外径向排列50.板条状晶体的晶面不清楚，但暴露于尿液的球形COM的外表面应具有相同的晶体面。目前的结果清楚地表明，OPN和RPTF-1具有相似的分布线剖面，其中它们在同心COM中周期性分布为大约4至6μm尺度的间隔层（图）。（图4c，d，4c，d，C，D，5B，C5b、c和补充表S1).这表明OPN和RPTF-1在暴露于尿液的COM的特定晶面上的吸附和掺入差异可以忽略不计。以往的体外研究表明，OPN对{100}、{121}和{010}面的COM生长有抑制作用51.当考虑这种抑制作用时，本结果表明OPN和RPTF-1可能抑制了同心COM生长，因为RPTF-1具有相似的钙结合能力，因此具有与COM相似的掺入效率。

Cal-A对CaOx晶体生长的体内抑制作用

在本结果中未观察到Cal-A在COM和COD晶体的特定晶面上的吸附（图。（图 2a2a 和和3a）。3Cal-A具有比OPN和RPTF-1更低的钙结合能力，并且存在于正面体COD晶体的外部和没有层压结构的镶嵌COM颗粒周围（图。（图2a，e2a，e 和和3a，e）。3答，e）。然而，Cal-A在体外研究中也已知会抑制CaOx晶体生长28.因此，Cal-A可能作为一种表面活性剂分子，在不掺入晶体的情况下影响形态和晶体生长速率39,40,52.在正常尿液条件下（即，没有不规则的高Cal-A浓度），Cal-A对COM和COD的晶体生长的抑制作用可能低于OPN和RPTF-1，因为OPN和RPTF-1通过掺入晶体来抑制晶体表面阶梯的发展。因此，肾结石中蛋白质的钙结合能力将有助于评估其对CaOx生长的抑制作用程度。

在同心COM中，Cal-A显示出距离为20至50μm的非周期性层（图。4c，d，C，D，5D5d 和补充表S1).已在结石形成者的尿液中发现 Cal-A28.因此，尿液中浓度的波动应该自然发生。然而，由于其对钙离子的亲和力较低，Cal-A浓度的微小波动可能不会记录在COM纹理中。Cal-A 作为抗炎蛋白在尿液中非周期性地排泄以响应炎症53,54.因此，由于不规则的环境变化，例如感染、损伤和出血，Cal-A 的非周期层可能会偶尔记录尿液中高浓度的 Cal-A。它对COM生长的抑制作用在很大程度上取决于其在生长晶体周围的浓度，因为几种肽对方解石晶体的生长具有这种依赖性42.当Cal-A在晶体周围的浓度较低时，Cal-A可能会通过部分占据生长表面来微弱地减缓COM生长，因为蛋白质不容易掺入CaOx中。在同心COM中，通过SEM观察发现的微小沉积物包围的间隙层与通过多IF成像发现的Cal-A层具有几乎相同的位置（图）。（图 6a-d）。6公元）。因此，当Cal-A层由于某些生物变化而由于其不规则的高浓度而变厚时，Cal-A可能通过广泛占据生长表面来作为CaOx生长的有效抑制剂。炎症是Cal-A分泌的触发因素，也可能影响结石形成的不同步骤，因为在使用肾结石模型小鼠的实验中发现了一种对肾结石形成具有促进和抑制作用的白细胞（即巨噬细胞）16.

多IF成像在整体肾结石形成中的可能应用

本工作将蛋白质的多IF成像的应用扩展到较硬的生物矿物样品，即肾结石。晶体成核、晶体生长、晶体聚集和晶体粘附被认为是肾结石形成的重要步骤。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 被体外研究报道为钙氧成核、生长和聚集的抑制剂48,49.目前多IF成像的扩展应用为先前体外研究暗示的蛋白质对CaOx生长的抑制作用提供了体内证据。

通过小鼠体内研究以及体外研究对蛋白质在每个步骤中的影响进行了调查14,15,26.例如，基于小鼠体内实验，已经报道了OPN作为晶体形成抑制剂和晶体粘附抑制剂的关键肾保护作用。26然而，根据最近使用 OPN 敲除小鼠的体内实验，已经报道了 OPN 促进晶体粘附到肾小管上皮细胞和增强 CaOx 结石形成14,15.在OPN敲除小鼠的肾结石中发现的完全不同的晶体形态也支持OPN在肾结石形成的多个步骤中的作用。目前的可视化方法将有助于评估小鼠体外研究中的蛋白质效应，甚至可用于评估人肾结石形成的不同步骤。这种新颖的分析将使我们能够解释不同蛋白质对CaOx结石形成的体内影响，从而为病理检查和个性化医疗管理人类肾结石疾病开辟一条途径。

结石收集和结石剖面的准备

从患者身上收集肾结石，并在日本名古屋市立大学进行分析。根据体红外光谱（IR）的信息，从我们数千个人肾结石收藏中挑选了15个CaOx肾结石样品，并制备了薄片。通过红外分析估算了石头的块状矿物组成。最初为地质调查设计的岩石学薄切片方法被应用于这项肾结石调查55.肾结石样品完全嵌入环氧树脂中并切割。横截面用磨料（SiC和Al）研磨2O3），然后使用环氧树脂将抛光表面粘附在载玻片上。进行第二次切割以使1毫米厚的样品平行于载玻片。然后将试样抛光至20-30μm的厚度，并通过金刚石浆料进行抛光。

偏振显微镜和傅里叶变换红外分光光度法

通过偏振显微镜观察组成肾结石的每种晶体的光学特征，并观察20-30μm厚的结石碎片切片。通过将观察结果与灶神星计算的典型COD晶体形状进行比较，确定每个COD平面的表面指数56.根据光学特征对晶体进行分类，然后用傅里叶变换红外分光光度计（FT/IR6100，JASCO）进行分析。测量波数范围为7800–350 cm-1.所有测量均在环境温度下进行。测量光斑尺寸设置为20×20μm2.使用RRUFF数据库根据获得的红外光谱鉴定晶相。

蛋白质基质的多色免疫荧光染色

用于分析矿物相的石块也用于使用Multi-IF染色分析蛋白质分布。用柠檬酸盐溶液（pH 6.0）处理薄片1分钟，以尽量减少蚀刻。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤切片，然后在60%牛血清白蛋白中用吐温1（PBST）在磷酸盐缓冲盐水中封闭20分钟。封闭后，将该切片与一抗在环境温度下孵育过夜。使用的一抗是小鼠单克隆抗钙颗粒蛋白A（1：100稀释，圣克鲁斯生物技术，sc-48352），兔多克隆抗骨桥蛋白（1：100稀释，圣克鲁斯生物技术，sc-20631）和绵羊单克隆抗人凝血酶原片段1（1：500稀释，加拿大安大略省Cedarlane ，CL20111AP）。然后将切片用PBS洗涤3次10分钟，然后与荧光偶联的二抗孵育1小时，避光。使用的荧光偶联二抗是与Alexa Fluor 488偶联的抗兔IgG（H + L）交叉吸附，与Alexa Fluor 546偶联的抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附，以及与Alexa Fluor 647偶联的抗绵羊IgG（H + L）交叉吸附。用PBS大量洗涤3次10分钟后，使用共聚焦自动荧光显微镜（尼康A1R）检测荧光。收集的激发和发射波长分别包括 OPN、RPTF-487 和 Cal-A 的 500 nm 激发（在 550 至 561 nm 之间收集的发射）、570 nm 激发（在 620 至 639 nm 之间收集的发射）和 663 nm（在 738 至 1 nm 之间收集的发射）。

从部分样品中观察到自发荧光（AF），但信号强度远低于本研究中讨论的蛋白质信号。还评估了对靶蛋白不具有特异性的抗体的结合。证实非特异性抗体中没有IF信号。进行阴性对照测试以评估假阳性信号的缺失（补充图。S5).对于抗体染色，使用同种型对照来检测任何非特异性结合。具体而言，用于对照的一抗是兔（DA1E）mAb IgG XP同种型对照（1：100稀释细胞信号传导），小鼠（G3A1）mAb IgG1同种型对照（1：100稀释细胞信号传导）和绵羊mAb IgG同种型（1：100稀释Novus），使用与上述相同的荧光标记二抗。用ImageJ构建线谱，每种蛋白质的最高和最低对比度分别为100%和0%。

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