科研丨北大肿瘤医院(IF:38): 肠道菌群介导的核苷酸合成减弱了直肠癌对新辅助放化疗的反应(国人佳作)

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

术前新辅助放化疗(nCRT)是局部晚期直肠癌(LARC)患者的标准治疗方法，但目前对其疗效异质性的影响因素知之甚少。在这项纵向研究中，研究人员对353份粪便样本进行了16S rRNA测序，发现患者接受nCRT后肠道微生物多样性降低。多组学数据整合显示，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)介导的核苷酸生物合成与LARC患者的nCRT耐药性有关，而对nCRT无反应的肿瘤的特征是DNA修复和核苷转运相关基因表达上调。补充核苷或普通拟杆菌灌胃处理可以保护癌细胞免受5-氟尿嘧啶或放疗的影响。研究人员分析735例患者的2205份血清样本后发现，尿酸是接受nCRT治疗的LARC患者的潜在预后标志物。综上所述，本研究揭示了肠道菌群介导的核苷酸生物合成在直肠癌对nCRT的反应中具有重要作用，并强调了在癌症治疗过程中破译癌细胞和肠道微生物之间的相互作用的重要性。

图文摘要

论文ID

原名：Gut microbiota-mediated nucleotide synthesis attenuates the response to neoadjuvant chemoradiotherapy in rectal cancer

译名：肠道菌群介导的核苷酸合成减弱了直肠癌对新辅助放化疗的反应

期刊：Cancer Cell

IF：38.585

发表时间：2022.12

通讯作者：詹启敏，王维虎

通讯作者单位：北京大学肿瘤医院

DOI号：10.1016/j.ccell.2022.11.013  

实验设计

结果

1. LARC患者的临床特征及放化疗对其粪便微生物群落的影响

本研究纳入了2018年1月至2019年11月期间接受nCRT治疗的126例LARC患者。根据研究设计，研究人员在患者接受nCRT治疗前2周至1天(Pre-nCRT [Pre])和治疗后相应时间点(Post-nCRT [Post])收集353份粪便样本[(治疗后采样时间点包括治疗开始后2周(Post1)、治疗结束后3天内(Post2)和治疗结束后2个月(Post3)(图1A和附表1))。此外，研究人员根据肿瘤退缩分级(TRG)和客观缓解情况，将116名可评估反应的患者分为应答者(TRG评分为0至1分，或达到临床完全缓解状态，共有82例)和无应答者(TRG评分2至3分，或nCRT后2个月内发生远处转移，共有34例)。排除混杂变量对组别的影响后，两组的临床基线变量没有显著性差异(附表1)。然后，通过16S rRNA测序(353份粪便样本)和宏转录组测序(91份粪便样本)(附表2)评估和分析患者肠道细菌特征的动态变化。

首先，研究人员基于Bray-Curtis距离进行置换多元方差分析，探讨了nCRT对LARC患者粪便样本中整体微生物群组成的影响(图1B)。主坐标分析结果显示，nCRT前后的样本存在明显的分离(图1B)，且nCRT后样本的个体间Bray-Curtis距离明显低于nCRT前样本(图1C)。根据16S rRNA扩增子序列变异(ASV)(图1D和1F)和宏转录组属组成(图1E和1G)估计的Shannon指数和逆Simpson指数显示，放化疗后粪便微生物多样性显著降低。α和β多样性的降低突出了放化疗对肠道菌群的影响，提示放化疗可能使LARC患者的肠道菌群复杂性降低并且更均匀。

图1. 实验设计和患者接受nCRT后粪便微生物群落的变化。

(A)本研究的实验设计。(B)使用Bray-Curtis距离对所有LARC患者粪便样本进行ASV水平的主坐标分析。(C) nCRT前后LARC患者粪便样本ASV水平Bray-Curtis差异距离的分布。(D和E) LARC患者接受nCRT前后基于粪便样本16S rRNA ASV(D)(Pre组为125份，Post组为228份粪便样本)和基于宏转录组的属组成获得的Shannon指数(E)(Pre组为34份，Post组为57份粪便样本)。(F和G) nCRT前后样本中基于16S rRNA ASV(F)(Pre组为125份粪便样本，Post组为228份粪便样本)和宏转录组属组成(G)(Pre组为34份粪便样本，Post组为57份粪便样本)获得的逆辛普森指数。使用Wilcoxon符号秩检验计算统计学显著性。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。  

2. 放化疗后LARC患者粪便微生物群发生改变

为了进一步分析患者放化疗前后粪便菌群的变化，研究人员在门水平上估算了组间的细菌丰度。结果显示，各组样本之间的肠道微生物群有相当大的差异(图2A)，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是最主要的两个门，分别占所有组ASV的74.47%和10.10%。此外，整个治疗期间不同时间点的微生物组成和多样性出现波动性变化(图2B和图2C)，这表明纵向采样对于准确识别微生物群变化非常重要，这一点在之前的研究中可能被遗漏。基于纵向样本，研究人员在不同分类水平探索与放化疗相对应的粪便菌群变化。在门水平上，与nCRT治疗后的样本相比，拟杆菌门(14.87% vs. 8.01%)在nCRT治疗前的样本中丰度更高；而厚壁菌门(75.47%)在nCRT治疗后的样本中丰度更高(图2D)。在属水平上，两组间共有36个属存在显著性差异(图2E和图2F)。在这些存在差异的分类群中，有几个是已确定的与结直肠癌有关的细菌，包括Alistipes、拟杆菌属(Bacteroides)和狄氏副拟杆菌属(Parabacteroides)，这些细菌在pre-nCRT组中丰度更高，而Actinomyces、粪球菌属(Coprococcus)和Dorea这三个曾被报道在结直肠腺瘤样本中丰度较高的菌属，在post-nCRT组中丰度更高(图2E和图2F)。为了进一步研究癌症患者放化疗后微生物群落的变化模式，研究人员表征了放化疗前后样本中细菌ASV的共丰度模式。结果表明，pre-nCRT组和post-nCRT组的大部分相关性都是正相关，表明微生态系统中微生物的关系以合作而非竞争为主(图2G)。基于NetShift分析，研究人员发现与丁酸生成相关的细菌属，包括Peptoniphilus、Blautia、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和Turicibacter，是直肠癌患者接受放化疗后微生物群中的潜在驱动分类群(图2H)。丁酸是正常结肠细胞的重要能量来源，可通过调节基因表达、炎症、分化和凋亡等方式影响肠道健康。研究表明，产生丁酸的细菌具有抗肿瘤活性。因此，由产丁酸微生物驱动的有益网络深化了对放化疗治疗直肠癌的认识。

图2. LARC患者放化疗后粪便菌群的变化。

(A)基于ASV注释的物种，治疗前(Pre)和治疗后(Post)癌症样本中门水平微生物的相对丰度。每组仅展示前10个丰度最高的门。(B和C)在不同时间点，基于16S rRNA ASV(B)和属丰度(C)的Shannon指数和逆Shannon指数的动态变化。(D)直肠癌患者粪便微生物中两个发生显著变化的与放化疗相关的细菌门:拟杆菌门和厚壁菌门。(E)在Post组(棕色)或Pre组(蓝色)中显著富集的细菌属。(F)比较(E)中两组Actinomyces、Coprococcus、Alistipes、Dorea、Bacteroides、Oscillospira、Blautia和Parabacteroides的相对丰度。(B、D和F)中Pre组和Post组的粪便样本分别为125和228份。使用Wilcoxon符号秩检验计算统计学显著性。(G)基于Pre(左)和Post(右)组粪便样本构建的微生物组共现网络。节点代表ASV，并根据门着色，节点大小代表与其他节点的连接数量。绿色和红色的线分别代表正相关和负相关。(H)潜在驱动菌属，基于原始微生物组的细菌网络分析的潜在驱动属，然后将这些微生物组与放化疗相关联。大的红色节点表示放疗后特别重要的驱动类群。线的颜色表示Post组(红色边)和Post组(绿色边)的连接。  

3. 接受放化疗的LARC应答者和无应答者粪便微生物群的差异

为了进一步确定粪便微生物群差异与放化疗反应之间的关系，研究人员根据NCCN TRG和客观应答情况将患者分为应答者和无应答者(图3A和图3B)，然后对两组之间的宏转录组数据进行线性判别分析效应分析，以确定影响患者对放化疗反应的物种。鉴定出7种和11种细菌分别与放化疗应答和无应答状态相关(附表3)。一项随机临床试验表明，在与放化疗反应相关的物种中，Bacteroides coprophilus与供体粪便菌群移植后溃疡性结肠炎的疾病改善显著相关。在放化疗后的无应答组患者中，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)是丰度最高的物种(图3C和3D)，而在放疗前，普通拟杆菌并不占优势(附表4)，这表明它是放化疗后被选择的。这一结果与之前的观察结果一致，之间的研究根据16S rDNA V1-V2高变区扩增子测序推断，放化疗后无应答组患者肠道菌群中的拟杆菌属(Bacteroides)丰度升高。有研究发现，在溃疡性结肠炎患者中，普通拟杆菌具有致病作用，因为从进展期结直肠腺瘤到癌变，普通拟杆菌的丰度显著增加。由于应答组和无应答组样本之间的微生物组组成不同，研究人员随后比较了这两组的细菌物种在群落水平上的共丰度关联。与无应答组的稀疏相关网络相比(附图1A)，放化疗应答组的相关网络更强(附图1B)，体现在节点数(115 vs. 97)和边数(338 vs. 125)、平均度(2.939 vs. 1.289)和平均聚类系数(0.042 vs. 0.015)等方面。在应答组中，几种细菌，包括Rothia mucilaginosa、V. parvula、W. confusa和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，在细菌相互作用中具有核心作用。据报道，R. mucilaginosa可以通过减少IκB-α磷酸化和NF-κB靶基因的表达来抑制NF-κB通路的激活，对病原体诱导的促炎反应有抑制作用。嗜热链球菌是一种产乳酸细菌，可以通过分泌β-半乳糖苷酶抑制结直肠癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡，从而抑制结直肠肿瘤的发生。以这些有益菌为中心的网络可能有利于化疗后直肠癌患者的健康。如附图1B所示，几种拟杆菌属细菌表现出很强的相关性，并在无应答组的生态网络中占据中心位置，表明它们在网络中起着关键作用。在NetShift分析中，除了普通拟杆菌外，其他几种拟杆菌属细菌，如Bacteroides faecis、Bacteroides ovatus和Bacteroides massiliensis，是化放疗无应答直肠癌患者肠道微生物组中的潜在驱动物种(图3E)。在LARC患者的粪便样本中，B. ovatus、B. massiliensis或B. faecis的丰度与B. vulgatus的丰度呈正相关(图3F)。在无应答LARC患者中这些拟杆菌属细菌的富集促使研究人员继续探究它们在这些患者对nCRT耐受性中的潜在功能。

图3. 粪便微生物群与LARC患者对放化疗的反应有关。

(A和B) 34例无应答者和82例应答患者的代表性放射学(A)和苏木精-伊红染色病理(B)图像(比例尺，50 μm)。红色箭头代表病变部位。(C)放化疗后应答组和无应答组的物种显著富集。(D)比较放化疗前后应答组和无应答组普通拟杆菌的相对丰度。箱线图展示了最小值和最大值、带中位数的四分位距和离群值。在Pre组中，应答组和无应答组的粪便样本分别为18和16份。Post组中，应答组和无应答组的粪便样本分别为32和25份。使用Wilcoxon符号秩检验计算统计学显著性：***p < 0.001。(E)基于初始微生物组的细菌网络的潜在驱动物种，然后分析它们与放化疗无反应的相关性。大的红色节点表示与放化疗无反应相关的特别重要的驱动类群。线的颜色表示无无应答组(红色线)和应答组(绿色线)中存在的联系。(F)从宏转录组测序中获得的普通拟杆菌的相对丰度(log2转换)与B. ovatus、B. massiliensis和B. faecis的相对丰度(log2转换)之间的Pearson相关性。  

4. 宏转录组学结合代谢组学揭示核苷酸生物合成与LARC患者的nCRT耐药性有关

为了深入了解微生物群落变化可能带来的功能后果，研究人员分析了从粪便宏转录组推断出的功能模块，并注释了放化疗后应答组和无应答组之间差异丰富的20个MetaCycle模块(附表5)。混合酸发酵和鸟苷二磷酸-甘露糖生物合成模块在放化疗后的应答组中被鉴定为差异丰富，这与之前的研究结果一致，即甘露糖可通过影响三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径中的葡萄糖代谢来抑制肿瘤生长并增强化疗反应中的细胞死亡。据报道，核苷酸从头合成可增加乳腺癌转移或胶质母细胞瘤的治疗耐受性。有趣的是，在本研究中，放化疗后，与核苷酸生物合成相关的几个模块在无应答组中富集(图4A)。在核苷酸生物合成相关基因中，我们发现放化疗后无应答组9个嘌呤合成相关基因(包括purF，编码嘌呤从头生物合成中的限速酶)和5个嘧啶核苷酸合成相关基因表达升高(图4B和4C)，而它们在放化疗前的无应答组中表达量并不高。与转录组学观察结果一致的是，放化疗后两组之间差异丰富代谢物的功能富集揭示了与核苷酸生物合成相关的几种途径，包括哺乳动物中嘌呤和嘧啶核苷酸的补救通路以及嘧啶脱氧核糖核苷酸的补救通路(图4D)。放化疗后，无应答组患者样品中与核苷酸生物合成相关的底物水平升高，包括次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺苷和胸腺嘧啶(图4E)。为了探索引起这种粪便代谢物差异的微生物种类，研究人员整合基于代谢模型的代谢物和物种丰度，对微生物组-代谢组数据集进行了无偏倚整合分析。有趣的是，研究人员顺利预测了与核苷酸生物合成相关的几种代谢物(如鸟苷和肌苷)会受到拟杆菌(包括B. ovatus、Bacteroides thetaiotaomicron、B. vulgatus和Bacteroides xylanisolvens)的调控(图4F)。HUMAnN分析进一步揭示了普通拟杆菌在核苷酸从头合成通路中发挥主要作用(图4G)。接下来，研究人员分析了细菌培养上清，发现普通拟杆菌可以产生许多与核苷酸生物合成相关的代谢物(图4E)。综上，这些数据揭示了普通拟杆菌来源的核苷酸生物合成在在宿主患者放化疗反应中的潜在作用。

图4. 与直肠癌对nCRT反应相关的核苷酸合成途径。

(A-C)放化疗前后，应答组和无应答组微生物转录组改变的功能富集。图中展示了简化的细菌嘌呤(B)和嘧啶(C)生物合成途径与已识别的反应相关基因。Pre组中应答组和无应答组的粪便样本分别为n=18和n=16。Post组中应答组和无应答组的粪便样本分别为n=32和n=25。采用Wilcoxon符号秩检验计算统计学显著性。*p < 0.05，**p < 0.01。(D)放化疗后应答组和无应答组粪便中基于VIP评分的差异丰富代谢物的富集途径。(E)放化疗后应答组(n = 11)和无应答组(n = 14)粪便中差异代谢物的绝对丰度。图中展示了平均值±标准差；通过非配对t检验进行比较；*p < 0.05，**p < 0.01。(F)网络图表示粪便微生物类群(红色节点)对特定代谢物(绿色节点)的显著贡献(校正后的p < 0.05)。(G)通过HUMAnN分析，不同细菌物种对腺苷核苷酸从头生物合成I途径的贡献。  

5. 补充核苷可以保护癌细胞免受5-氟尿嘧啶和电离辐射处理的影响

研究人员试图确定补充核苷酸生物合成源是否会影响癌细胞对化疗和放疗的反应。研究人员在结直肠癌细胞中添加细胞渗透性核苷混合物(胞苷、尿苷、胸苷腺苷和鸟苷)，然后通过MTS实验和集落形成法测定其对5-氟尿嘧啶(5-FU)和电离辐射的敏感性。结果表明，外源性补充混合核苷以剂量依赖性方式显著增加了癌细胞在5-FU(图5A和5B)和辐射(图5C和5D)处理后的存活率，而分别通过布喹那(BQN)或霉酚酸(MPA)阻断嘧啶或嘌呤的从头生物合成，降低了癌细胞在治疗中的存活率(图5A和5C)，这些结果强调在这些治疗过程中核苷酸生物合成在癌细胞存活中的重要作用。有趣的是，我们观察到外源性核苷在治疗期间补救了BQN和MPA对癌细胞存活的影响(图5A和图5C)，表明外源性核苷补救在抗癌治疗期间癌细胞存活中起着关键作用，同时通过核苷转运体抑制剂S-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(NBMPR)阻断外源性核苷的摄取，减弱了混合核苷类物质对5-FU或放射治疗的保护作用(图5E-5G)。磷酸化组蛋白H2A变体(γH2AX)是DNA修复蛋白在受损染色质位点组装所必需的，辐照后γH2AX的持续表达已被用于监测肿瘤细胞对DNA损伤的敏感性和修复。通过免疫荧光检测4-Gy辐射24小时后γH2AX的表达，观察到补充核苷组γH2AX病灶数量显著减少。相反，尽管存在混合核苷，但额外的NBMPR导致辐照后γH2AX处于高水平(图5H)。在5-FU治疗后的结直肠癌细胞中也观察到类似的效应(附图2)。核苷补充不太可能防止辐射引起的DNA损伤，据报道DNA损伤后数秒内就开始修复。因此，补充的核苷可能是核苷酸生物合成的来源，促进了癌细胞受损DNA的修复，导致γH2AX丰度降低。总之，这些体外结果表明，外源性核苷通过更有效的DNA损伤修复能力来保护结直肠癌细胞免受辐射和5-FU的影响。

图5. 补充核苷可以保护癌细胞免受5-FU或辐射的影响。

(A-F)用100μM 5-FU(A)/4-Gy辐射(C)、混合核苷和嘧啶生物合成抑制剂BQN或嘌呤生物合成抑制剂MPA处理的HCT116结直肠癌细胞的活力或存活率。梯度浓度的混合核苷对5-FU(B)或4-Gy辐射(D)处理下HCT116细胞活力或存活率(辐射后第8天)的影响。胸苷的浓度是其他核苷的1/3。HCT116细胞经100 μM 5-FU (E)或4-GY辐射(F)、30 μM混合核苷和核苷转运体抑制剂NBMPR处理后的存活率。(A-F)中的数据显示为平均值±标准差；单因素方差分析；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。(G)辐射后第8天HCT116细胞集落形成实验的代表性图像(3次独立实验)。(H) 4-Gy辐射24 h后HCT116细胞γH2AX染色的代表性图像(3次独立实验)(比例尺为5 μm)。  

6. 补充核苷或普通拟杆菌灌胃可保护异种移植瘤或原位肿瘤免受辐射或5-FU治疗的影响

然后，研究人员进一步研究了补充核苷对体内辐射处理的异种移植物存活的影响。鉴于HCT116细胞是对辐射最敏感的细胞系之一，研究人员将其用于异种移植瘤模型。当移植瘤平均大小达到64 mm3时，研究人员将小鼠随机分为3组，每组接受对照或放疗(RT)。RT组分别于辐射前24 h和辐射后72 h在瘤周注射核苷混合物(Nuc + RT)或PBS (PBS + RT)(图6A)。通过免疫荧光分析了辐射暴露4小时后的肿瘤亚群。结果显示，放疗后肿瘤中γH2AX水平升高，但补充核苷混合物后其水平显著降低(图6B和附图3A)。在携带MC38细胞(小鼠结肠腺癌细胞系)的免疫正常小鼠中也观察到类似效应(附图4)。在PBS+RT组中，RT几乎阻止了肿瘤的生长，但放疗和核苷混合物的联合治疗略微减缓了肿瘤生长(图6C、6D和附图3B)。这些体内研究结果证实，外源性补充核苷混合物可保护结直肠癌细胞免受RT的影响。

研究人员接下来试图分析普通拟杆菌(BV)，这一在放化疗后无应答临床患者中核苷酸生物合成中起主要作用的优势物种(图3C、3D和4E-4G)，是否会影响体内的治疗反应。为了模拟临床患者的结直肠肿瘤与肠道微生物群之间的相互作用，研究人员通过将MC38细胞注射到小鼠盲肠壁上建立了原位结直肠癌模型。由于对小鼠盲肠中的原位肿瘤进行精确辐射具有局限性，研究人员还利用5-FU为基础的化疗方案，该方案可引起DNA损伤(尤其是S期双链断裂)，以评估普通拟杆菌对原位肿瘤小鼠模型的作用(图6E)。接种两天后，小鼠随机分为对照、普通拟杆菌灌胃(BV)、5-FU、5-FU与BV组合(5-FU+BV)、5-FU与BV和NBMPR组合(5-FU+BV+NBMPR)组(图6F-6I)。研究人员分析了普通拟杆菌给药四个周期后的肿瘤亚群。BV组和对照组之间的肿瘤大小没有明显变化(图6F和6G)，表明BV在没有治疗的情况下不能加速肿瘤生长。然后，研究人员还比较了5-FU、5-FU+BV和5-FU+BV+NBMPR组的肿瘤体积，发现与临床患者的观察结果一致，即普通拟杆菌给药极大地减弱了5-FU治疗的效果，而这种减弱可以通过核苷转运体抑制剂NBMPR逆转(图6I)。同样，与5-FU组相比，BV+5-FU组的γH2AX水平下降，而在NBMPR给药后上升(图6H)。总之，这些结果表明，普通拟杆菌介导的核苷酸生物合成可以保护原位结直肠肿瘤免受5-FU治疗的影响。

图6. 补充核苷或BV可保护异种移植瘤或原位肿瘤免受辐射或5-FU治疗的影响。

(A) HCT116异种转移瘤模型的原理设计。分别于放疗前1天和放疗后第3天经瘤周注射核苷混合物(Nuc)。(B)用抗γH2AX抗体(每组3只小鼠)通过免疫荧光分析放疗4 h后各组小鼠肿瘤的代表性图像(比例尺，5 μm)。(C和D)辐射后第5天各治疗组间肿瘤体积的比较(n = 6只/组，均值±标准差，单因素方差分析)。(E-G) MC38原位小鼠模型的时间线示意图和化疗方案。BV, 普通拟杆菌；i.p. 腹腔注射。NBMPR，核苷转运体抑制剂。(F)显示了代表性的原位肿瘤，(G)计算相应治疗组原位小鼠模型的肿瘤体积(对照组n =5只，BV组n =6只，均值±标准差，t检验)。(H)各治疗组γH2AX免疫组化结果。下图为原位小鼠肿瘤和邻近小肠的苏木精-伊红(H&E)染色形态学图像(比例尺，100 μm)。(I)计算各治疗组的原位肿瘤体积(n = 6只/组，均值±标准差，单因素方差分析)。 ∗p < 0.05。  

7. DNA修复和核苷水平与直肠癌患者的放疗反应相关

由于外源性核苷酸生物合成在化放疗反应中具有关键作用，研究人员进行了基因富集分析，以确定直肠癌患者放疗相关肿瘤组织的转录组变化。基于TCGA数据库中直肠癌患者的敏感和耐药数据，研究人员观察到参与DNA修复的基因在无应答肿瘤中表达增加(图7A和7B)。DNA修复基因集中靠前的子集包括两个成熟的核苷酸补救合成基因，HPRT和APRT47，强调了放疗期间核苷酸补救合成的重要性。研究人员还观察到与含核苷酸化合物运输相关的基因富集(图7C)，如SLC29A1和SLC35B3。SLC29A1定位于血浆和线粒体膜，可介导细胞从周围介质中摄取核苷(特别是腺苷)。同样，在化疗后无反应的直肠癌患者的血浆(图7D)和肿瘤组织(图7E)中，与核苷酸生物合成有关的代谢物水平升高。这些数据表明，已鉴定的核苷转运体和代谢物在治疗后癌细胞存活或在核苷从头生物合成活性有限或低效的情况下具有有益作用。血清尿酸是外源和内源性嘌呤代谢的产物，其丰度随核苷生物合成活动发生变化，这启发我们分析其在直肠癌患者血清中的水平，以寻找潜在的临床应用。放化疗后无应答(TRG2和TRG3)的直肠癌患者血清尿酸水平升高(图7F)。二元逻辑回归分析显示，LARC患者nCRT后血清尿酸水平与预后不良相关(图7G)。此外，放化疗后血清尿酸每增加1 μM，预后不良的风险就会增加0.46%(图7G)。尿酸水平在预测独立数据集的直肠癌患者对放化疗的反应方面表现一般(曲线下面积=0.732)(图7H)，这提高了尿酸水平可能用于评估直肠癌患者放化疗后预后的可能性。

图7. DNA修复和核苷水平与直肠癌患者对放疗的反应相关。

(A-C)直肠癌患者放疗相关敏感和耐药肿瘤组织的转录组基因集富集分析。(D和E)放化疗后无应答直肠癌患者血浆(D，应答组n=14，无应答组n=20)和肿瘤组织(E，应答组n=12，无应答组n=26)中核苷酸生物合成相关代谢物水平升高。数据以平均值±标准差展示；通过非配对t检验进行比较；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。(F)放化疗后应答(TRG0和TRG1)和无应答(TRG2和TRG3)直肠癌患者的尿酸水平。箱线图展示最小值和最大值、四分位数、中位数以及离群值。采用Kruskal-Wallis检验确定四组中位数之间的差异，用Wilcoxon秩和检验来比较每对的差异。TRG0、TRG1、TRG2和TRG3的n=199、253、257和26。**p < 0.01, ***p < 0.001。(G) 551名直肠癌患者的预后与三个不同时间点的尿酸丰度之间的二元逻辑回归分析。横轴为放化疗后尿酸水平的丰度(Post2)，纵轴为患者预后，0为改善，1为恶化。(H)根据551名直肠癌患者不同时间点的尿酸丰度构建的广义线性模型，研究了独立数据集184名直肠癌患者尿酸水平对放化疗反应的预测性能。  

讨论

术前放化疗已应用于直肠癌、胃腺癌、食管癌等多种癌症的治疗。不幸的是，许多患者对该疗法反应甚微或出现耐药性，这阻碍了该疗法的临床应用。为了解决这一问题，研究人员以直肠癌为模型来解读癌症患者对nCRT耐药的机制，并证明肠道微生物介导的核苷酸合成能够调节LARC患者对nCRT的反应。

核苷酸代谢的增加是癌症的一个标志，可以合成用于DNA复制和细胞生物能量的嘧啶和嘌呤，促进肿瘤细胞不受控制的生长。抑制DNA中核苷酸合成的治疗方式被广泛用于控制肿瘤生长和诱导细胞死亡。放化疗可以通过破坏癌细胞的DNA来根除癌细胞或控制其增殖。因此，获取用于修复受损DNA的核苷酸可能是肿瘤细胞产生耐药性的原因。本研究的多组学分析揭示，在受辐射的菌群和对放化疗无反应的肿瘤中，参与核苷酸生物合成和DNA修复的分子的丰度增加。核苷酸补救合成途径与从头合成途径的相对贡献可能取决于生长条件或特定组织。在以前的研究中，有人认为循环核苷酸的浓度太低，无法仅通过补救合成途径满足肿瘤的核苷酸需求。最近，有研究发现核苷酸补救合成途径及其代谢物可以在低葡萄糖条件下促进肿瘤细胞的增殖。胞苷可以通过尿苷-胞苷激酶产生的单磷酸胞苷更直接地通过补救途径合成。嘌呤补救合成途径比嘌呤从头合成使用更少的三磷酸腺苷，因此，核苷酸补救合成途径能量效率更高，可能赋予癌细胞更多生长优势。体外功能验证实验表明，外源补充核苷通过更有效的DNA修复能力增加了结直肠癌细胞在辐射或5-FU治疗中的存活率(图5)，但是目前还不清楚体外使用的核苷浓度是否完全代表直肠癌的肿瘤微环境。

越来越多的证据显示，肠道微生物的组成与其宿主的生理和病理状态有关，包括癌症的发生和发展以及肿瘤对治疗的敏感性。然而，驱动肿瘤细胞耐药性的生物机制和宿主-微生物相互作用尚未阐明。在这项研究中，研究人员发现nCRT治疗后患者具有独特的粪便微生物群落。多组学分析以及体外和体内的功能验证结果表明，微生物介导的核苷酸合成与直肠癌患者对nCRT的耐药性有关。同样，以前发表的一些研究揭示了微生物群衍生或介导的核苷酸代谢对宿主健康和肠道疾病严重程度的影响。例如，肠道菌群中的部分细菌可以加强宿主嘌呤的代谢，从而加剧小鼠模型中的结肠炎，而微生物群衍生的嘌呤是粘液屏障功能和伤口愈合的关键底物来源。肠道微生物是人类肠腔内的共生生物，与直肠肿瘤紧密相关。即使体循环中与核苷酸生物合成有关的代谢物的浓度不是很高，但直肠肿瘤组织和微生物群之间的空间毗邻关系可能有利于它们的相互作用，微生物群衍生的低浓度核苷也可能到达直肠肿瘤。相应地，在化疗后无反应的直肠癌患者的肿瘤组织中观察到与核苷酸生物合成有关的代谢物水平升高(图7E)。虽然细菌核苷与直肠肿瘤治疗反应之间的确凿因果关系需要在未来的研究中进一步确定，但可以推断的是，微生物群介导的核苷酸生物合成在调节直肠肿瘤对放化疗的反应中发挥了不可或缺的作用。

有趣的是，观察到LARC患者放化疗后血清尿酸水平与预后不良相关(图7F-7H)。尿酸不仅是一种随核苷酸生物合成活性波动的下游代谢物，还可以作为一种抗氧化剂，在人体防御氧化应激中发挥作用。因此，直肠癌细胞中尿酸水平升高可能保护肿瘤细胞免受氧化损伤，提高放化疗后肿瘤细胞的存活率。以前也有研究表明，尿酸可以通过抑制尿苷单磷酸合成酶和积累5-FU的竞争物质乳清酸来降低结直肠癌细胞对5-FU的敏感性，这进一步支持了本文关于尿酸参与直肠癌放化疗敏感性的结论。在本研究中，血清尿酸水平可用于预测独立数据集直肠癌患者的反应。这表明，尿酸作为嘌呤代谢的下游代谢物，可用于评估直肠癌患者放化疗后的预后，但在未来的研究中，尿酸对放化疗疗效影响的具体机制还需要大样本验证。  

综上所述，作者在此提出了直肠肿瘤对放化疗的反应可由肠道微生物群介导的核苷酸生物合成调节的概念，本研究的数据强调了考虑癌细胞和肠道微生物群之间的相互作用对于深入了解癌症患者对临床治疗反应的机制的重要性。