快报 | Droplet Digital PCR量化检测结核分枝杆菌对异烟肼的异质性耐药

作者：张思琦，陈晓红，林忠惠，谭耀驹，梁斌，潘昱颖，黄明翔，苏碧仪，胡小曼，许晔，李庆阁

第一作者及单位：张思琦，厦门大学生命科学学院；陈晓红和林忠慧，福建省福州肺科医院

通信作者及单位：许晔和李庆阁，厦门大学生命科学学院

Quantification of Isoniazid-Heteroresistant Mycobacterium tuberculosis Using Droplet Digital PCR.

Zhang S, Chen X, Lin Z, Tan Y, Liang B, Pan Y, Huang M, Su B, Hu X, Xu Y, Li Q.

J Clin Microbiol，2023:e0188422.

doi: 10.1128/jcm.01884-22.

PMID: 37195177.

研究背景

异烟肼（INH）是重要的一线抗结核药物，然而耐异烟肼结核分枝杆菌的出现使药物的有效性减弱。耐药结核病可由传播导致或由于治疗不足而在疾病进展期间出现。异质性耐药是敏感菌和耐药菌共存的一种状态，反映了结核分枝杆菌种群的混合感染或从“不固定”到“固定”耐药的中间过程。经典比例法药物敏感性试验（简称“药敏试验”）依赖于在含药培养基上获得的菌落数与无药培养基上获得的菌落数的比值进行耐药检测。对于异烟肼，比例法药敏试验确定的临界耐药比例为1%，即当异质性耐药样本中的耐药菌比例超过1%，临床上的化学治疗很可能无法达到预期效果。因此，异烟肼耐药检测的替代方案应具有对1%耐药突变的识别敏感度，否则异质性耐药样本可能被错误地归类为敏感；此外，替代方案应可以量化异质性样本的突变百分比，以便监测耐药比例的动态变化，在耐药发生前进行预警。

尽管传统药敏试验（DST）可以满足上述要求，但其周转时间长达数月，无法提供及时的药敏试验结果。随着结核分枝杆菌耐药分子机理的不断深入研究，通过检测基因突变来快速诊断耐药结核病的技术日益受到重视。目前，已有多种方法应用于基因诊断，如Genotype MTBDRplus、Sanger测序、探针熔解曲线分析法等，而且这些方法对异质性耐药识别的敏感度均低于传统DST（1%）。数字PCR能够实现对模板的绝对定量，特别适用于在过量野生型DNA背景下罕见靶标的检测。在本研究中，作者提出了基于数字PCR的异烟肼耐药检测方案，并在临床样本（包括培养样本和痰液样本）中进行了验证，还利用数字PCR的定量性能对接受治疗的患者进行了纵向监测，为结核病的精准诊断提供新策略。

研究方法

本研究基于液滴式数字PCR（ddPCR），使用“脱落探针”设计策略检测引起异烟肼耐药的主要突变，katG 315密码子、inhA启动子，ahpC启动子。采用临床分离株和痰液样本，以DST作为“金标准”，以商业试剂盒MeltPro TB/INH作为对照方法，对ddPCR的临床诊断性能进行评估。此外，利用ddPCR定量特性对接受治疗的结核病患者的异烟肼耐药状态和细菌载量进行纵向监测。

研究结果

一、异烟肼数字PCR定量体系的设计

异烟肼ddPCR耐药检测在3个反应内检测异烟肼耐药的所有主要突变。每个扩增子内包含两条探针：检测探针（drop-off探针）和参考探针（REF探针）。反应A靶向katG 315密码子，反应B靶向inhA启动子区域-17至-8位点，反应C靶向ahpC启动子区域-39~-30位点和-15~4位点。经标准株H37Rv和含有不同突变的耐药株验证，所有MT信号都可以与WT信号清晰区分（图1）。

图1  检测异烟肼耐药突变的ddPCR测定的示意图

二、数字PCR体系的分析性能

研究分析了6种异烟肼耐药突变的异质性识别能力，分别为katG 315密码子突变（AGC→ACC，AGC→ATC，AGC→AAC）、inhA启动子区域突变（-15C→T）和ahpC启动子区域突变（-30C→T，-10C→T），均能够达到1%的识别敏感度。在100~50 000拷贝/反应，实际检出的突变频率与预期的突变频率之间有良好的线性相关性（R2＞0.99）。以上结果支持了异烟肼ddPCR体系对突变定量的可靠性。检测梯度稀释的异质性标准品确定体系4条检测探针的最低检测限（LOD），均低于传统药敏试验定义的耐药临界值（图2）。

图2   预期突变频率与实际检出突变频率的相关性

三、异烟肼数字PCR体系的临床性能评估

研究通过2种类型的样本进行验证。在338份临床分离株中，ddPCR在94.5%的表型异烟肼耐药株中检出耐药突变，其中97.6%的表型敏感株为野生型；与MeltPro TB/INH分析相比，ddPCR多检出5份异质性耐药样本（图3），从敏感株中多检出1份异质性耐药样本。在194份痰标本中，ddPCR在87.5%的异烟肼耐药株中检出耐药突变，其中4份为异质性耐药标本，ddPCR检测96.6%的异烟肼敏感株为野生型；与MeltPro TB/INH分析相比，ddPCR多检出2份异质性耐药样本（图3）。所有ddPCR检出的异质性耐药标本均进行了直接Sanger测序或突变富集的Sanger测序验证，结果证实了ddPCR检测的准确性。

假设katG、inhA启动子、ahpC启动子在结核分枝杆菌基因组中呈现单拷贝分布，作者通过194份痰标本输出的DNA拷贝数推算细菌载量。正如预期的那样，3个基因获得的细菌载量彼此密切相关（r=0.997~0.999, P<0.0001）。值得注意的是，42.3%的痰标本细菌载量少于或接近涂片镜检的最低阈值，这部分样本采用涂片检测将很大概率被错误地归类为结核分枝杆菌阴性。

图3   异质性耐药样本的典型结果

注 IS-221和IS-338为临床分离株。SP-132和SP-181为痰液样本

四、抗结核治疗患者的追踪监测

在治疗期间检测患者的细菌载量将为疾病进展提供直接判断依据。本研究开展纵向研究揭示了结核病患者治疗期间未报道的事实。首先，ddPCR检出的细菌载量与疾病症状之间存在显著相关性。例如，患者#4在治疗后几周出现气促、胸痛、细菌负荷升高等症状，提示肺结核和肺外结核患者在治疗期间必须加强化疗方案的监测并及时干预。其次，我们的发现强调了高血糖状况会干扰抗结核药物发挥疗效。患者#5和患者#6的细菌载量下降缓慢，并且在32周内始终未转成阴性，提示此类患者有必要增加复查次数，监测血糖指标，以防止耐药结核病的出现。最后，我们观察到单耐药结核病患者（#7）的细菌载量下降相比多耐药患者（#8和#9）更快，进一步强调了耐药检测的重要性。由于本研究纳入的患者数量有限，上述观察结果是否适用于一般人群尚需进一步验证。尽管有这一局限性，但我们预计采用细菌载量检测工具（如ddPCR）进行纵向监测将改善结核病患者的管理。

图4  对接受治疗的结核病患者痰样本中的细菌负荷进行纵向监测

研究结论

本研究所建立的ddPCR定量检测方法对突变菌的识别敏感度可达到1%的临界耐药比例，这是目前绝大多数分子检测方法难以实现的。本研究在概念上使分子检测回归到定义耐药结核病的经典比例法。ddPCR兼具表型DST的敏感度和分子检测的速度，可能代表了第3代结核病药敏检测方案。总体而言，基于ddPCR开发的结核病药敏检测可为患者提供及时、准确的定量检测结果，对实施结核病个体化治疗及降低耐药结核的发生具重要意义。

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供稿：张思琦

编辑：孟莉

审校：范永德

发布日期：2023-06-02