LNP-mRNA通过激活DC引发强烈T细胞免疫响应！

诱导有效的T细胞反应对肿瘤免疫治疗和预防许多传染病至关重要。在过去的几年里，mRNA疫苗已经成为强大的T细胞免疫反应的有效免疫激活剂和诱导剂。最近，Moderna（美德纳）和辉瑞/BioNTech基于脂质纳米颗粒（LNP）封装的mRNA疫苗获得批准彻底改变了疫苗领域。LNP的优点是易于设计和配制，从而产生有效、安全的疫苗。然而，在LNP功效方面仍有很大的改进空间，例如，通过优化脂质成分和针对特定组织细胞调整优化LNP。已知mRNA递送依赖于LNP的脂质组成，且效率主要由阳离子脂质决定。除此之外，胆固醇和辅助脂质在mRNA转染效力中也起着重要作用。

研究方法

在这里，通过选定阳离子脂质，用β-谷甾醇（β-sitosterol，sito）取代胆固醇，并改变辅助脂质DOPE含量，设计了一系列LNP库，研究了该LNP库诱导抗原呈递和T细胞增殖的能力，筛选出四种优选LNP制剂（C12-200-cho-10%DOPE、C12-200-sito-10%DOPE、cKK-E12-cho-10%DOPE和cKK-E11-sito-30%DOPE）。基于以上四种LNP制剂递送EGFP mRNA时，四种LNP制剂都具有永生细胞系的高转染效率。骨髓树突状细胞（BMDCs）具有刺激幼稚T细胞、记忆T细胞和效应T细胞的强大抗原呈递能力，用于评估免疫反应。将编码卵清蛋白（OVA mRNA）的mRNA封装在LNPs中以激活BMDCs并刺激T细胞增殖，OVA mRNA LNPs以浓度依赖性方式内化后，导致共刺激受体（CD40和CD86）和IL-12的表达上调，BMDC高度激活，从而刺激T细胞增殖（方案1），这些结果表明，T细胞增殖强烈依赖于LNP的组成，为开发高效的LNP-mRNA疫苗配方提供了方向。

方案1  mRNA-LNP激活T细胞产生免疫反应流程

结果

LNP设计和表征

设计制备了10种LNP制剂，其中可电离脂质C12-200/cKK-E12和DMG-PEG2000分别固定在50%和1.5%。为了研究DOPE的作用，通过取代胆固醇（或β-谷甾醇）的含量，使DOPE含量在10至49 mol%之间变化（图1a和b）。

图1

不同LNP的设计和表征通过动态光散射（DLS）检测，所有得到的LNP具有相似的直径（～120nm），多分散指数（PDI）＜0.20，以及接近中性的表面电荷（图1c和e）。所有LNP的mRNA包封率也相当，都在80%左右（图1d）。因此，用β-谷甾醇取代胆固醇或增加DOPE不会改变LNP的物理化学特性，并且LNP在4°C下储存时至少稳定1个月（图2a–d）。

图2  LNP在4℃储存时的稳定性

不同LNP的细胞转染效率

为了研究mRNA的递送和翻译，将编码绿色荧光蛋白（GFP）的EGFPmRNA包封在LNP中，并转染不同细胞，将转染效率作为不同细胞上脂质组成的参数进行比较。首先在HeLa和Calu3细胞中比较不同可电离脂质的LNP的转染效率，与MC3相比，C12-200和cKK-E12都增强了HeLa和Calu-3中mRNA的转染效率（图3a和b）。这种结果并不意外，因为MC3是为siRNA递送而设计的，而mRNA递送效率较低。接下来，研究了β-谷甾醇取代胆固醇的效果，β-谷甾醇的引入显著增强了两种细胞系中含MC3 LNP的GFP表达。当阳离子脂质为cKK-E12时，GFP表达仅在HeLa细胞中增强，而对于基于C12-200的LNP制剂，没有观察到增强效果。最后研究了增加DOPE含量是否会增强mRNA的递送和GFP的表达。然而，从LNP中DOPE含量的变化不能得到相应趋势。因此仅观察到用β-谷甾醇取代胆固醇来提高转染效率。

图3

不同包封EGFP-mRNA的LNP制剂在Hela和Calu-3细胞中的转染效率接下来研究永生化抗原呈递细胞（DC2.4）和巨噬细胞（THP-1和RAW264.7），以评估LNP mRNA转染对永生细胞免疫细胞免疫反应的影响。在三种细胞系中，含有cKK-E12的LNP比含有C12-200的LNP具有更高的GFP表达（图4a–c）。

图4

LNPs包封EGFP mRNA在永生免疫细胞系中的转染效率β-谷甾醇的替换增加了cKK-E12 LNP在DC2.4和RAW264.7中的转染效率，但没有增加C12-200 LNP的转染效率。当增加DOPE含量取代胆固醇时，没有观察到C12-200 LNP的转染增强。相反，在这三种细胞中cKK-E12 LNP的转染效率都有不同程度增强。然而，当cKK-E12 LNP中有β-谷甾醇取代时，在DC2.4和RAW264.7细胞中观察到转染增强，但在THP-1细胞中没有（图4a–c）。总之，所有含C12-200或cKK-E12的LNP可以用来转染永生免疫细胞系，效率高于商业mRNA转染试剂；然而，通过β-谷甾醇替换胆固醇和DOPE含量增加来提高转染效率取决于特定的细胞系。

图5  EGFP mRNA-LNPs在BMDC细胞中的转染效率

EGFP mRNA转染原代BMDC

接下来研究了LNP包封EGFP mRNA在原代抗原呈递细胞（APC）BMDC中的转染效率。共聚焦显微镜成像显示，所有LNP制剂都有效的将mRNA递送到BMDC细胞内，并且优于商业转染试剂Lipofectamine（图5a）。β-谷甾醇提高了以cKK-E12作为可电离脂质的LNPs的转染效率，但不提高C12-200的转染效率（图5b）。最后，增加DOPE含量取代胆固醇并不能增强C12-200和cKK-E12中 LNP的GFP表达（图5b）。

原代BMDCs的激活

为了研究LNP递送mRNA是否可以激活原代BMDCs，用上述LNP制剂分别包封编码卵清蛋白的mRNA（OVA-mRNA）转染BMDCs，24h后检测表面共刺激分子CD40和CD86的表达情况。结果表明，与未处理的BMDC或与游离OVA mRNA相比，所有LNP都不同程度诱导增强了CD40和CD86的表达，这说明激活了BMDC（图6a和b）。CD40和CD86的阳性百分比和荧光强度比较显示C12-200 LNP制剂之间没有显著差异。此外，增加 DOPE含量和β-谷甾醇替换都没有促进BMDC的激活（图6a，b）。而在含cKK-E12的LNP中，观察到cKK-E12-cho-10%DOPE和cKK-E11-sito-30%DOPE诱导CD40和CD86表达更强。

图6

OVA mRNA-LNPs在BMDC细胞中的转染效率和IL-12的分泌DC的活化通常可以促进炎症因子的表达。因此，这里检测了BMDC上清液中细胞因子IL-12（p70）的表达，与空白BMDCs和游离OVA mRNA相比，所有LNP都增强了的IL-12（p70）产生（图6c），然而在LNP之间没有观察到显著差异。

LNPs对CD8+T细胞的扩增和细胞因子产生的影响

肿瘤和病毒疫苗接种的目的是通过APC启动来扩增抗原特异性CD8+T细胞，从而产生大量细胞毒性效应T细胞，这些细胞在体内迁移可以清除肿瘤或感染。为此，这里评估了不同LNP诱导的OVA特异性T细胞扩增。将BMDC与LNP共孵育4小时，然后加入CD8（OT-I）T细胞共培养72小时。所有LNP以mRNA浓度依赖的方式诱导强效OT-I增殖，显著强于空白和游离OVA mRNA组（图7）。T细胞增殖在最低浓度（200 pg/mL）时可忽略不计，而OVA mRNA浓度为20 ng/mL时，T细胞增殖稳定在~90%。而C12-200-cho-10%DOPE、C12-200-sito-10%DOPE、cKK-E12-cho-10%DOPE和cKK-E11-sito-30%DOPE LNP制剂用1 ng/mL的OVA mRNA就高效刺激了OT-I T细胞扩增。这表明这四种LNP制剂即使在较低OVA mRNA浓度下也能够引发T细胞高效增殖，这可以作为引发强大T细胞反应的优选LNP制剂。

图7  不同浓度OVA mRNA-LNP对OT-I T细胞扩增的影响 T细胞上清的细胞因子释放

使用ELISA检测了LNP刺激后72小时后，OT-I细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ和TNF-α的表达（图8a–c）。与未处理或游离OVA mRNA处理的细胞相比，用LNPs处理细胞后细胞因子表达显著上调。在两种mRNA浓度（5和20 ng/mL）下评估了LNP之间细胞因子产生的差异。与OT-I细胞增殖数据一致，用β-谷甾醇替换胆固醇并不能提高C12-200 LNPs的T细胞反应和细胞因子产生。C12-200 LNP中DOPE含量的增加既没有增强T细胞反应，也没有增强细胞因子IL-2的释放。类似的，DOPE含量的增加也没有增强cKK-E12 LNPs的细胞因子IL-2的分泌，并且在使用β-谷甾醇的情况下，仅在30%DOPE时显示出IL-2分泌的一些增强，而在49%DOPE时又降低了。值得注意的是， C12-200-cho-10%DOPE, C12-200-sito-10%DOPE, cKK-E12-cho-10%DOPE 和 cKK-E12-sito-30%DOPE这四种 LNP制剂诱导了OT-I T细胞上清液中IFN-γ和TNF-α更高水平的表达分泌。总之，这些结果表明，上述的四种LNP制剂高效诱导了T细胞增殖和炎性细胞因子释放。

图8  ELISA检测OT-I T细胞上清中IL-2、IFN-γ和TNF-α释放水平

讨论

通过研究LNP文库将mRNA递送到BMDC中，评估T细胞活化对LNP-mRNA候选疫苗开发的影响。LNPs已证实具有高效递送mRNA的能力，已成为公认的一种mRNA疫苗递送载体，筛选LNP制剂对促进T细胞快速增殖和产生强烈免疫反应至关重要。通过此研究证明，LNP-mRNA可以促使BMDC显著激活、增强T细胞增殖和细胞因子释放。筛选出了四种LNP制剂（C12-200-cho-10%DOPE、C12-200-sito-10%DOPE、cKK-E12-cho-10%DOPE和cKK-E12-sito-30%DOPE），它们表现出高效的T细胞扩增和细胞因子释放，这将有助于开发mRNA疫苗以治疗癌症。

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