科研丨华南师大: 海水养殖影响沿海环境中的抗生素耐药基因组和微生物组(国人佳作)

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

由于海水养殖的快速发展，抗生素越来越多地被使用并释放到海洋环境中，导致抗生素耐药性的传播。本研究调查了抗生素的污染、分布和特征、抗生素耐药基因(ARGs)和微生物组。结果显示，在我国沿海环境中共检出20种抗生素，以红霉素-H2O、恩诺沙星和土霉素为主。在沿海海水养殖区，抗生素浓度显著高于对照区，并且在南方检测到的抗生素种类多于北方。恩诺沙星、环丙沙星和磺胺嘧啶残留具有较高的耐药选择风险。β-内酰胺、多药和四环素耐药基因在海水养殖场检出率较高，且丰度明显较高。在检测到的262个ARGs中，分别有10个、26个和19个被列为高风险、当前风险和未来风险ARGs。主要的细菌门是变形菌门和拟杆菌门，其中25个属是人畜共患病原体，特别是排在前10位的弓形杆菌属(Arcobacter)和弧菌属(Vibrio)。条件致病菌在北方海水养殖场的分布更为广泛。变形菌和拟杆菌是高风险ARGs的潜在宿主，而条件致病菌与未来风险ARGs相关，对人类健康存在潜在威胁。  

图文摘要  

论文ID

原名：Mariculture affects antibiotic resistome and microbiome in the coastal environment

译名：海水养殖影响沿海环境中的抗生素耐药基因组和微生物组

期刊：Journal of Hazardous Materials

IF：14.224

发表时间：2023.3

通讯作者：应光国，何良英

通讯作者单位：华南师范大学环境研究院

DOI号：10.1016/j.jhazmat.2023.131208

实验设计

结果

1. 抗生素污染和耐药选择风险

在我国沿海海水养殖环境中检出了各类抗生素。在海产养殖水中检测到53种目标抗生素中的20种，浓度范围为39.5 - 1930 ng/L，而在对照样品中共检测到17种抗生素(浓度范围为25.3 - 660 ng/L)(附表7)。红霉素-H2O(ETM-H2O)、恩诺沙星(EFX)、氧四环素(OTC)为主要抗生素，其他常见抗生素还有氟苯尼考(FF)、氧氟沙星(OFX)、罗红霉素(RTM)、洛美沙星(LFX)、ETM-H2O(图1，附表7)。此外，双氟沙星(DIF)、诺氟沙星(NFX)、磺胺多辛(SDX)和OTC仅在海水养殖区(MS)检出。MS区的平均总抗生素浓度为390 ± 37.4 ng/L，显著高于对照区(CS)(185±21.1 ng/L) (p < 0.05)(图2a)，差异主要由DIF、ETM-H2O、NFX和OTC引起(图2b)。

抗生素残留浓度在配对的MS和CS之间存在差异(附图S1，附表7)。MS1-5和MS7-12的抗生素总浓度显著高于其对应CS区(图1)。而且，不同MS区之间也存在差异，例如MS1的抗生素总浓度最高，其次是MS7和MS5，均显著高于其他MS区(附图2)。从区域上看，辽宁(MS1，CS1)、福建(MS7-MS8，CS6-CS7)、广东(MS9，CS8)和广西(MS10-MS11，CS9)的抗生素总浓度高于其他省份(图1)。虽然南北之间的抗生素总浓度没有差异，但某些特定抗生素的检出率或浓度存在差异(图2a)。如NFX仅在北方检出，CFX、DIF、SDZ、SDX和OTC仅在南方检出；北方EFX、FF和NFX的浓度明显高于南方，而南方LFX、MFX、ROX、SDZ、SMX和TMP的含量较高(图2b)。

抗生素残留造成的潜在耐药选择风险如附图3所示。在MS区，EFX具有较高的选择风险(RQ > 1)，OTC、ETM-H2O、SDZ和CFX具有中等选择风险(0.1 < RQ < 1)。在对照区(CS)，SDZ、CFX和EFX具有中等选择风险(0.1 < RQ < 1)(附图3)。

图1 中国海水养殖环境中抗生素(ng/L)和ARGs (copies/mL)的分布。

缩写：MS，海水养殖区；CS，对照区；ETM-H2O，红霉素-H2O；EFX，恩诺沙星；OTC，氧四环素；FF，氟苯尼考；LFX，洛美沙星；OFX，氧氟沙星；SMX，磺胺甲恶唑；TMP，甲氧苄氨嘧啶；CFX，环丙沙星；SDZ，磺胺嘧啶；MAR，马波沙星；FL，氟罗沙星；SMZ，磺胺二甲嘧啶；LIN，林可霉素；RTM，罗红霉素；NOV，新生霉素；SMM，磺胺间甲氧嘧啶；SCP，磺胺氯哒嗪；NFX，诺氟沙星；DIF，二氟沙星。*表示MS与其对应CS之间的差异(p  < 0.05，Wilcox检验)。

图2 沿海海水养殖环境中抗生素残留及ARGs丰度分析。

(a) MS与CS、北方与南方抗生素总浓度的差异。(b)导致分布差异的特定抗生素。(c) Circos图显示了MS vs. CS和北方vs.南方ARGs分布。(d)沿海海水养殖中ARGs丰度的显著性差异。*表示差异显著(p < 0.05，Wilcox检验)。  

2. ARGs的分布和健康风险

研究人员从这些海水养殖系统中共鉴定出262种ARGs(附表8-10)。这些ARGs对医疗保健中心和畜牧业中常用的几乎所有主要类别的抗生素都具有耐药性。对β-内酰胺类(19.6%)和氟喹诺酮类(17.1%)耐药的ARGs含量最高，其次是四环素类(15%)、氨基糖苷类(14.1%)和MLSB(11.6%)耐药基因(图3a)。这些海水养殖系统中ARGs的主要耐药机制包括抗生素失活(42.3%)、外排泵(27.8%)、细胞保护(20.6%)、转座酶(4.11%)、整合酶(0.56%)和其他未知途径(4.5%)(图3a)。海水养殖区ARGs总丰度为8.52×104- 3.58×107 copies/mL，显著高于对照区(5.56×103- 7.34×106 copies/mL)(图2 cd；附表9)。值得注意的是，有22种ARGs仅在海水养殖区检测到，一些对临床重要抗生素具有耐药性的ARGs在海水养殖区丰度更高，如β-内酰胺(blaCTX-M-05、blaCTX-M-06、blaOKP、blaOXA1、blaOXY、blaPSE、blaSHV-02和cfiA)、万古霉素(vanC2、vanRB、vanSB、vanWB、vanXD和vanYB)和氯霉素(mexF)(附图4，附表10)。从ARGs的空间分布来看，北方ARGs的总丰度在1.6×104 - 7.4×107copies/mL之间，显著高于南方(8.2×102 - 5.3×106copies/mL)(图2c)。这主要是由多种ARGs的丰度导致的(图2d)，其中qacH-02在北方明显更丰富，yceE/mdtG-01仅在北方检测到(附图5)。

将检测到的ARGs分为3个风险等级。分别有10个、26个和19个ARGs被分类为高风险、I级风险和II级风险(图3b，附表9)，其中大多数对有效清除世界卫生组织重点病原体的抗生素具有耐药性。在这些ARGs中，blaSHV-1和tetM1在海水养殖区的丰度显著较高，blaVIM仅在南方检测到，而blaTEM在北方检测到的频率明显更高(附图6，附表9)。

图3 沿海海水养殖环境中ARGs的特征和风险分级。

(a)条形图和饼状图显示了海水养殖系统中不同类型ARGs或不同机制的数量。(b) Pheatmap图显示了高风险、I级和II级ARGs的相对丰度。  

3. 沿海海水养殖区的微生物组

研究人员在所有样品共鉴定出34个细菌门，以变形菌门、拟杆菌门、蓝藻门(Cyanobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)丰度最高(图4a)。变形菌门和拟杆菌门在所有样品微生物群落中占优势，分别占20.1-87.1%和3.13-45.3%(图4a)。占比前10的细菌属中，致病菌弓形杆菌属(Arcobacter)和弧菌属(Vibrio)分别占0.02-51.5%和0.04-47.1%(附图7)。

所有数据集中共鉴定出7393个扩增子序列变异(ASVs)，其中2468个物种在所有样本中都存在，分别有2681个和2307个ASVs在MS和CS中特有(附图8)。南方和北方的样本中分别有3660个和2669个特有ASVs(附图8)。MS与CS的微生物多样性指数无显著差异。但与北方相比，南方微生物群落的Shannon指数和Pielou指数显著较高。LEfSe分析共鉴定出23个生物标志物(LDA＞2)，其中13个在海水养殖区更丰富，10个在对照区更丰富(图4b)。同时，在南方和北方的微生物群落之间共鉴定出32个生物标志物(LDA＞3) (图4b)。

此外，研究人员共鉴定出25个人畜共患病条件致病性细菌属(图9)。MS组的条件致病菌ASV显著高于CS组，北方的条件致病菌ASV显著高于南方(图4c)。研究人员将数据集中80%以上样本中存在的ASV所对应的微生物定义为核心微生物。在7393个ASVs中，201个构成了核心微生物，包括放线菌门、拟杆菌门、蓝藻门和变形菌门的细菌，分属于7科18属(图4d)。在核心微生物组中，弧菌属是最具优势的分类群。

研究人员通过计算MIP来评估沿海海水养殖环境中微生物造成的潜在疾病风险(图5)。结果显示，北方微生物群落的总体MIP值显著高于南方(图5b)。造成这一差异的主要病原体包括铜绿假单胞菌(S. aeruginosa)、S. baumannii、S. cholerae和S. lwoffii (图5c，附图10a, MIP LV1-LV2)，这些细菌可导致人类败血症、腹泻和皮肤病变(附图10b)。根据系统发育分析，研究人员计算了βNTI和RCbray。大多数βNTI大于2或小于-2，少数βNTI介于-2和2之间(图5d)。CS和南方样本的RCbray值均小于0.95，MS只有一小部分RCbray值大于0.95(尤其是北方)(图5f)。从群落组成上看，南北间差异显著，而MS和CS的相似性较大(图5e)。

图4 海水养殖系统中的微生物群落。

(a)门水平微生物群落的相对丰度。(b) LEfse鉴定MS与CS、南方与北方之间差异最大的分类群。分支图显示在目、科和属水平上的差异。每个圆圈代表系统发育水平。(c) MS vs. CS、北方vs.南方病原菌ASV数量(p < 0.05，Wilcox检验)。(d)核心微生物群系统发育树。

图5 沿海海水养殖环境中微生物群的分布与特征。

(a)沿海海水养殖微生物群落的相似性(%)和组成独特性(MNS)。显示相似微生物群分布的全局图，其中百分比表示相似指数(%)。当MNS≥0.12时，微生物组被认为是“新的”。(b) MS与CS、南北之间的病原菌总体微生物指数(MIP)值。(c) MIP LV1揭示的前10种丰富的致病菌(p  < 0.05，Wilcox检验)。(d) β-NTI指示的海水养殖微生物群落的组装机制。(e)非度量多维标度分析(NMDS)显示了微生物群落差异。(f) MS和CS、南北地区中对群落组装有影响的主要过程的百分比。  

4. 海产养殖区微生物组与全球微生物组的比较

研究人员根据每个海水微生物组组成的独特性来计算MNS(Microbiome Novelty Scores)。MS(除MS4、MS6、MS8外)和5个CS样品(CS1、CS2、CS4、CS7、CS8)的MNS均为> 0.12，属于新发现的微生物群(图5a)。有趣的是，数据显示，此研究的微生物群落与数据库中几个国家海水样本的细菌群落相似度高达85%，特别是巴拿马(90.5%)、西班牙(90.4%)、美国(88.9%)、法国(88.1%)和澳大利亚(87.9%)(图5a)。

5. 抗生素耐药基因组和微生物组的相关性

最后，研究人员通过相关性分析，探讨抗生素耐药基因组与微生物组的关系(图6、附图11)。总抗生素与MLSB、β-内酰胺酶、多药耐药ARGs呈显著正相关。特别是，OTC、NOV、LIN、TMP、FF与总ARGs之间存在显著正相关(图6a)。ARGs和MGEs也有极显著的正相关(图6b)。

不同属的细菌与ARGs有很强的相关性(图6c)。为了确定ARGs的微生物来源及其潜在风险，研究人员评估了条件致病菌与高风险ARGs的相关性。在沿海海水养殖环境中，变形菌和拟杆菌可能是高风险ARGs的潜在宿主，包括CTX-M-2、dfrA12、qnrA、blaVIM、tetM2、sul1和dfrA1(附图11a)。条件致病菌存在较强的共线性(尤其是变形菌门的属(附图11b)，如鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)与ermJ-ermD、aacA-aphD、oleC、mtrD-03；巨单胞菌属(Megamonas)与aadA9-01、cmr；链球菌(Streptococcus)与qacA、tetV、pmrA(图S11c)。值得注意的是，巨单胞菌属、Brevundimonas、弧菌属、Photobacterium和Comamonas这5种条件致病菌与未来风险ARGs显著相关(附图11d)。

研究人员还利用结构方程模型(SEM)评估抗生素、金属和基本水质参数(附表2)对抗生素耐药基因组和微生物组的影响(附图12)。从p值(0.245)、卡方检验(20.60)和近似均方根误差(0.05)来看，SEM与数据拟合良好(附图12)。最终SEM与Spearman相关性分析结果一致(图6)。研究结果表明，养殖环境中的抗生素对细菌丰度和ARGs有直接影响。此外，MEGs和细菌丰度是抗生素耐药基因组的主要直接驱动因素。此外，细菌多样性对细菌的功能组成和多样性均有显著影响(附图12)。令人惊讶的是，ARGs丰度也直接影响了细菌的功能多样性。

图6 环境变量、细菌类群和ARGs之间的相互关系。

(a)环境变量与水生环境ARGs之间的Spearman相关性。(b) MGEs和ARGs的共存现象。(c)不同ARGs与细菌分类群之间的相互作用网络。

讨论

1. 中国沿海海水养殖区的抗生素残留情况

本研究检测出各种抗生素(如ETM-H2O、EFX、OTC和FF)，反映了中国沿海地区广泛使用抗生素(图1)，沿海沉积物中的抗生素残留也支持了这一现象。不同养殖场的抗生素使用差异很大。海参养殖场(MS1)的ETM-H2O残留量高于其他位点(图1，附表7)，说明在海参培养过程中抗生素的使用率较高，且ETM-H2O在海水中长久残留。这也与海洋生产业相一致：海洋生产越多，抗生素检出越多(附图13，附图14)。值得注意的是，中国北方海水养殖中使用的抗生素在许可范围内，而南方海水养殖则不在许可范围内。因此，我国海水养殖业，特别是南方海水养殖业对抗生素的使用监管不严。然而，在距离海产养殖场5公里以上的对照区也检测到17种抗生素，这表明抗生素可以通过洋流运送到更遥远的海洋环境，这与在南极洲和深海发现抗生素的研究一致。

监测我国沿海海水养殖环境中抗生素的动态变化一直是一个挑战。虽然LC-MS/MS在抗生素的检测中表现出良好的性能，但成本高，使用难度大，在提取和检测过程中需要更多不环保的有机溶剂。现在，一些便携式传感器通过结合表面增强拉曼光谱和密度泛函理论计算来快速检测抗生素。移动传感器的快速、低剂量、便携的抗生素检测能力将使在海洋养殖环境中进行动态抗生素检测变得更加容易。

2. 沿海海水养殖区的抗生素耐药性和风险

海洋环境中频繁检测到抗生素和ARGs(图1-3)也表明，捕鱼和洋流等海产养殖活动促进了沿海海洋环境中抗生素耐药性的传播。众所周知，广泛使用抗生素导致海水养殖中抗生素耐药性的迅速发展。本研究发现，ARGs在中国沿海海产养殖中普遍存在，这与之前的一些研究一致。与对畜牧业、城市地下水和堆肥过程的研究不同，海产养殖系统中的ARGs与抗生素之间存在明显的相关性，这表明抗生素影响了海洋环境中抗生素耐药性的分布和发展。β-内酰胺类、万古霉素类和四环素类药物的ARGs是导致MS和CS区之间ARGs分布差异的主要因素。此外，多药ARGs在研究区域广泛分布，这与之前在北极原始地区的研究一致。更令人惊讶的是，北方海产养殖中ARGs的相对丰度明显更高(图2c)，这与中国湖泊和水库中发现的模式完全不同。结果表明，海水养殖可能会加剧检测到的10种高风险ARGs的扩增，其中sul1是主要ARGs，在水、土壤、粪便和空气等各类环境中都能检测到。此外，高风险ARGs β-内酰胺酶的过度传播已造成重大公共卫生问题。

本研究发现，变形菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门和放线菌门是海产养殖系统的核心微生物和优势微生物。在海水养殖系统的前10个属中(附图7)，弓形杆菌属和弧菌属是人畜共患的食源性和水源性病原体。此外，海产养殖系统中微生物诱发疾病的风险很高，特别是在北方(感染、泌尿生殖系统和呼吸系统)(附图10b)。鉴于在北方发现的微生物多样性较低(附图8)，作者推断海水养殖增加了条件致病菌的流行，因为较高的微生物多样性有助于维持更稳定的生态位。

海水养殖系统中的微生物组呈现出新颖性，并显示出较高的微生物致病性潜在风险，特别是在北方(图5a，图5e)，表明海水养殖可以影响和改变海洋环境中的微生物组。此外，基本水质参数也可以解释这一点，所有样品的TN均超过了安全范围(0.5 mg/L)，MS中的TP值超过0.045 mg/L(附表2)。核心微生物与ARGs呈显著正相关，说明核心微生物是ARGs潜在的传播宿主。本研究表明，高风险ARGs主要由拟杆菌和变形菌携带，而未来高风险ARGs主要由条件致病菌携带。这与之前关于ARGs宿主的研究结果一致。这项研究揭示了海水养殖可以增强病原体对抗生素的耐药性，构成潜在的公共卫生风险。

3. 沿海海水养殖区的生态过程

本研究的核心微生物生态位广泛，微生物多样性较低，群落组装以生态位选择为主。虽然海洋微生物群落的组装受确定性和随机性因素的影响，但在海水养殖环境中，确定性过程主导着细菌群落，βNTI绝对值大于2(图5d)。其中，一致的变量选择强度在所有海水样品的确定性过程(βNTI>2)中占主导地位，而均质选择和漂变的分布较小(图5f)。有趣的是，扩散限制只影响MS的群落组装过程，特别是在北方(图5f)。

结合SEM，作者发现环境变化(如理化指标、金属、抗生素等)可以改变海洋的物理化学条件。这创造了新的资源和空间，可以促进或抑制微生物的随机传播和定植。此外，南北之间降水和温度的日变化可能是调节微生物群落组装的关键。虽然随机过程可能导致环境变化，但海水微生物组成主要由确定性因素决定，这表明海洋微生物群落的变化需要更长的时间才能发生。

结论

沿海海水养殖环境中常检出抗生素，并存在潜在的耐药选择风险。海洋环境中含有种类多样、数量丰富的ARGs，包括那些对临床重要细菌产生抗生素耐药性的ARGs。ARGs在海水养殖环境中富集，并进一步向周围环境扩散。海水养殖环境中微生物群以变形菌门和拟杆菌门为主，构成了海水养殖的核心微生物群。条件致病菌在海水养殖系统中普遍存在，并与高风险ARGs存在显著相关性，构成了海水养殖系统微生物疾病的高风险。与全球不同生境的微生物群相比，海水养殖微生物群表现出新的分类和功能特征。沿海海水养殖环境中微生物群落的组成主要受确定性过程的支配。空间因素影响随机性和确定性的相对作用。海水养殖系统可能受到抗生素耐药性的负面影响。鉴于海水养殖的快速发展，有必要严格监管抗生素的使用和海水养殖管理，以降低对人类健康的潜在风险。