聚焦共识 | 解析tNGS检测风向标，助推病原诊断“加速度”

更快、更准、更经济，tNGS检测持续升温

全球感染性疾病频发，病原体呈现复杂化、多样化的发展趋势，快速、准确地进行鉴别是有效防治的前提。其中，基于多重PCR的tNGS技术，因检测精度高、成本低、周期短等优势，持续升温，广泛应用于呼吸道感染、血流感染、中枢神经系统感染等临床检验领域。但tNGS的应用场景、结果解读等缺乏统一标准，为临床应用带来一定阻碍。

首个专家共识发布，助推行业高质量发展

2023年3月，国内正式发布了首个有关tNGS的专家共识——《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》，针对分枝杆菌病诊断上的高通量靶向测序的适应证、适宜送检人群及时机、阳性阈值的设定原则及判断标准等方面提出了专业的看法与科学的建议，同时也为tNGS在分枝杆菌病以外的病原领域应用提供了重要的参考价值。

共识要点

[1]应用tNGS检测分枝杆菌的适应证

靶向测序适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM病的诊断及鉴别诊断，也适用于菌量丰富的临床标本或菌株的耐药基因突变检测，或用于分枝杆菌耐药的诊断。

tNGS阳性阈值设定原则及判断标准

由于靶向测序采用的是扩增分枝杆菌多靶点分类基因的方法，判断标准不同于mNGS检测。特异性序列大于100条序列，且非单一靶点序列，可推荐作为阳性阈值判定标准；特异性数据小于100条序列，特别是同批次有获得大量序列数支持结核病诊断的标本时，需行其他方法学进行佐证，可进行实时荧光定量PCR确认。特异性数据小于10条序列时，尤当慎重判读，建议考虑另留取一份样本进行检测以佐证本次检测结果。如重复样本获得阳性结果，无论序列数如何，都应首先考虑其结核病诊断；如果复测结果为阴性，则暂不考虑其结核病诊断。

聚焦难点突破，促进临床应用

tNGS在病原检测领域的发展如火如荼，但目前仍有三大难点亟待解决。

01背景菌干扰

若检测的试剂未进行背景菌控制，一些临床常见病原体（例如大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等）可能会同时存在于核酸提取背景和试剂背景中，难以区分检测出的微生物究竟来源于样本还是试剂。 02气溶胶污染

由于PCR是指数级扩增，检测中可能有微量的PCR产物逸散在密闭空间中，同时PCR的灵敏度高，在检测环境中的轻微污染即可造成假阳性，导致检测结果不准确。

03检出率不足

非特异扩增、引物二聚体干扰、扩增偏好性等是降低检出率的主要因素，其引起的假阴性结果可能导致漏诊或误诊。

与“识”俱进，诺唯赞tNGS原料解决方案直击痛点

Vazyme立足行业痛点，提供了从核酸提取到测序文库构建的全套tNGS原料解决方案，推动tNGS高质量检测。

01 背景菌干扰如何排除？控菌升级，助力高标准检测！

Vazyme对tNGS关键产品的控菌工艺进行了升级，多参数指标控制原酶生产，多方面检测入厂原料，搭配专业人员和GMP洁净车间，执行严格的质控方案，可显著降低背景菌，助力tNGS高标准检测。

图1. 控菌工艺升级前后背景菌检测结果

02 如何应对气溶胶污染？最新防污染技术加持，结果更可信

对于气溶胶污染，常规采用传统的UDG酶消化法来清除，但Vazyme团队测试发现其清除效果有限。据此，Vazyme采用最新研发的防污染技术对多重扩增新品进行了防污染升级，其清除效果显著优于UDG酶消化法，从而增强检测结果可信度。

图2. USB酶防污染效果图（电泳图、qPCR结果）

03 检测率不足？酶定向进化+buffer优化，结果更准确

对于影响检测率的关键因素，Vazyme团队采用改良的热启动技术，搭配定向进化的聚合酶和精心优化的缓冲体系，可有效降低非特异扩增、引物二聚体和扩增偏好性，实现准确、均一、快速的多重扩增建库，适用于细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等多种病原微生物的检测。

Vazyme病原tNGS检测新品

扩增性能展示 (模拟病原样本+492重panel）

图3. 不同多重扩增试剂性能测试结果

参考文献

[1]高通量测序共识专家组. 高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识 [J] . 中华传染病杂志, 2023, 41(3) : 175-182. DOI: 10.3760/cma.j.cn311365-20221203- 00492.            

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