科研丨港科大: 花生壳乙醇提取物通过调节炎症和肠道菌群减轻小鼠的抑郁样行为(国人佳作)

编译：微科盟阿Z

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

花生壳是一种被大量浪费的农业副产品，急需回收利用。为了充分利用其药理成分，如木犀草素、圣草酚和5,7-二羟基色原酮，本文研究了花生壳乙醇提取物(PSE)对慢性不可预测轻度应激(CUMS)诱导的抑郁症小鼠的疗效。慢性应激持续10周，在建模的最后2周给小鼠灌胃100-900 mg/kg/天的PSE。通过蔗糖偏好、悬尾和强迫游泳来评估抑郁行为。小鼠海马的苏木精-伊红染色(H&E)、尼氏染色和TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色证实了脑损伤。分析生化指标，包括神经营养因子、神经递质、应激激素和炎症介质的水平。收集粪便进行肠道微生物组16S rDNA测序。PSE改善了抑郁小鼠的蔗糖水消耗，同时减少了悬尾和强迫游泳试验中的静止时间。同时，PSE的抗抑郁作用得到了组织化学染色改善、神经营养因子和神经递质水平升高以及应激激素水平下调的支持。此外，PSE治疗能够降低脑、血清和小肠中炎性细胞因子的水平。此外，肠道紧密连接蛋白(如occludin和ZO-1)表达升高，这与PSE治疗后肠道菌群的丰度和多样性升高相吻合。本研究验证了PSE对抑郁症的治疗效果，以及其对炎症和肠道菌群的调节作用，促进了这种农业废弃物的回收利用，并使其成为具有附加值的健康补充剂。

图文摘要

论文ID

原名：The ethanolic extract of peanut shell attenuates the depressive-like behaviors of mice through modulation of inflammation and gut microbiota

译名：花生壳乙醇提取物通过调节炎症和肠道菌群减轻小鼠的抑郁样行为

期刊：Food Research International

IF：7.425

发表时间：2023.3

通讯作者：Karl Wah-Keung Tsim

通讯作者单位：香港科技大学深圳研究院

DOI号：10.1016/j.foodres.2023.112765

实验设计

结果

1PSE可逆转抑郁样症状

花生壳用70%乙醇提取三次，干燥提取物(PSE)的产量约为总重量的5%：

在HPLC分析中，该提取物含有三个主要峰，分别为木犀草素、圣草酚和5,7-二羟基色原酮(图S1)，与之前的报道相似。经LC/MS定量分析，结果显示提取物中分别含有约0.71%、0.35%和0.18%的木犀草素、圣草酚和5,7-二羟基色原酮。在急性毒性试验中，PSE对小鼠的毒性最高可达50 g/kg。开展CUMS动物研究的概述如图1A所示。在小鼠抑郁周期的最后两周灌胃PSE。使用7.2 mg/kg/天的选择性血清素再摄取抑制剂氟西汀作为阳性对照。小鼠PSE的摄入量分为三个剂量：低剂量(0.1 g/kg/天)、中剂量(0.3 g/kg/天和高剂量(0.9 g/kg/天)。处理结束后，进行行为测试以评估绝望和快感缺乏的程度。CUMS小鼠的糖水消耗量减少(图1B)，这模拟了抑郁症患者的悲观状态。在所有浓度下，PSE的摄入都会刺激抑郁小鼠摄入更多的糖水，达到与氟西汀处理组相当的消耗量。因此，PSE和氟西汀逆转了CUMS引起的体重减轻(图1C)。在悬尾和强迫游泳行为测试中，PSE表现出比氟西汀更强的治疗效果，即PSE处理的抑郁小鼠表现出更短的静止时间(图1D&E)。这些结果表明，PSE能有效缓解小鼠抑郁样行为，其效果与氟西汀相当。

通过组织化学试验揭示了CUMS手术和给药后小鼠大脑的组织学变化。H&E染色显示，对照小鼠的海马形态健康，齿状回神经元密集排列。相反，CUMS组的神经元排列松散，间隙明显，细胞数量减少(图2A)。PSE和氟西汀处理可减轻损伤，使细胞排列更紧密、密度更高(图2A)。此外，TUNEL染色显示抑郁小鼠的大脑荧光信号增加，这代表了细胞损伤。相比之下，在齿状回中几乎看不到荧光点(图2A和B)。在Nissl染色中也发现了类似的情况，抑郁小鼠的CA3区神经元呈三角形和萎缩形态(图2A)。与对照组相比，PSE和氟西汀处理组的形态学变化较少，受损神经元的比例较低(图2B和C)。这些结果证实了PSE在脑组织水平上对抑郁症的疗效与氟西汀相同。

图1. PSE可减轻抑郁样症状。

(A) CUMS程序示意图。
(B)蔗糖偏好试验、
(C)体重测量、
(D)悬尾试验和(E)强迫游泳试验，如方法部分所述。
数据表示为平均值±SEM，n=10。(#)与未经处理的空白组相比，p＜0.05；(*)与CUMS组相比，p＜0.05。对照组：未经处理的空白组；CUMS：抑郁模型组；氟西汀：CUMS+氟西汀(7.2 mg/kg)；PSE：CUMS+低、中或高剂量(100、300、900 mg/kg) PSE。

图2. PSE对海马形态学变化的影响。

(A)海马齿状回区域的H&E和TUNEL染色，以及尼氏染色，观察给药小鼠的CA3区域。 显示了典型图像。 星形箭头表示TUNEL染色标记的受损DNA和尼氏染色标记的异常神经元。
(B)定量TUNEL染色的荧光强度。
(C)尼氏染色的结果通过受损神经元的密度来量化。 (#)与对照组比较， p ＜0.05； (*)与CUMS组比较， p ＜0.05。

2PSE可改善抑郁症的生物标志物

基于PSE对动物抑郁症的治疗效果，采用生化分析方法来研究其治疗的潜在机制。单胺类神经递质及其受体的丰度是抑郁症最确定的结果。同时，抑郁症的症状以神经营养因子减少为特征。本研究中，CUMS小鼠的皮层和海马显示出显著较低水平的分析神经递质和神经营养因子(图3A和B)。氟西汀显著恢复了这些下降的参数水平。PSE处理，特别是高剂量处理，可提高神经递质的水平(图3A)。在神经营养因子的表达中也发现了类似的诱导作用：高剂量PSE对皮层和海马中神经营养因子表达的诱导最强(图3A&B)。多项证据表明，抑郁症的进展与神经炎症高度相关。事实上，在CUMS处理下，皮层和海马组织中的炎症生物标志物，即IL-1β、IL-6和TNF-α的水平受到显著刺激(图3C)。所有剂量的氟西汀和PSE处理都能有效抑制皮层和海马中诱发的炎性细胞因子，即IL-1β、IL-6、TNF-α。

图3. PSE改善抑郁小鼠脑组织的生物指标。

PSE和氟西汀对药物治疗小鼠海马/皮层组织(A)神经递质、(B)神经营养因子和(C)炎性细胞因子水平的影响。(#)与对照组比较，p＜0.05；(*)与CUMS组比较，p＜0.05。下丘脑-垂体-肾上腺轴等内分泌系统的失调伴随着抑郁，不断分泌应激激素，以进行对抗或逃避。CUMS模型刺激血清中应激激素，即ACTH、皮质醇和促肾上腺皮质激素释放因子的产生，分别增加了6倍、5倍和2倍(图4A)。氟西汀处理几乎使这些应激激素恢复到正常水平。

PSE剂量依赖性地降低了ACTH和促肾上腺皮质激素释放因子的水平：

低剂量PSE对皮质醇的调节最强(图4A)。同时，在抑郁状态下，血清中的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS均被显著诱导(图4B)。氟西汀具有抗炎作用，但TNF-α除外。不同剂量的PSE处理降低了炎症标志物的水平(图4B)。血清IL-6水平是对PSE处理最敏感的细胞因子。

受损的肠道屏障导致抗原从肠道渗漏到循环系统，从而导致炎症的发生。CUMS诱导后小肠occludin和ZO-1表达下调40%以上(图5A)。氟西汀和PSE能够将蛋白质水平逆转到与对照组相似的水平(图5A)。相应地，PSE降低了肠组织中的炎症标志物，如IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS(图5B)。综上所述，上述结果表明PSE在对抗抑郁症方面具有多种治疗作用。

图4. PSE可缓解血清中的应激激素和细胞因子。

测定PSE和氟西汀对药物治疗小鼠血清(A)应激激素和(B)炎性细胞因子水平的影响。(#)与对照组比较，p＜0.05；(*)与CUMS组比较，p＜0.05。    

图5. PSE可调节小肠组织的细胞因子和连接蛋白。

采用Western blot和ELISA法分别检测PSE和氟西汀对药物治疗小鼠小肠组织(A)紧密连接蛋白ZO-1和occludin以及(B)炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、LPS水平的影响。(#)与对照组比较，p＜0.05；(*)与CUMS组比较，p＜0.05。

3PSE调节肠道菌群

从小鼠粪便中提取肠道微生物DNA，并根据标准程序进行16S rDNA测序。展示了每个样品的稀疏曲线，表明DNA测序深度足够(图S2)。α-多样性分析显示，在OTU水平上，CUMS模型组Shannon和Chao两个指标均低于对照组(图6A)。氟西汀和高剂量PSE的Shannon分析呈升高趋势。低剂量和中剂量PSE能够逆转α-多样性的两种分析结果(图6A)。采用PCoA分析测定各组在OTU水平上的β-多样性，其中未经处理的对照组和CUMS组的特征区分明显(图6B)。此外，处理组与模型组存在差异。在门和属水平上进行群落分析。乳杆菌属(Lactobacillus)是厚壁菌门(Firmicutes)的优势属，在CUMS组中高度富集，在其他组中含量较低(图6C)。通过LEfSe分析比较CUMS组与其他组之间的进一步差异。对照组和PSE组含有较高水平的毛螺菌科(Lachnospiraceae)，这是一种消耗果胶的细菌科，在免疫调节和抑郁症治疗中发挥积极作用(图6D)。然而，在同样严格的FDR阈值为4的情况下，氟西汀组除了拟杆菌门的Muribaculaceae外，与模型组没有太大差异。

此外，测序样本与其生物化学数据相关联，以确定科水平上与抑郁症相关的肠道微生物群。如相关热图所示，神经营养因子和神经递质聚集在一起，而不是细胞因子和应激激素(图7)。放线菌门(Actinobacteria)的棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)与细胞因子/应激激素升高和神经营养因子/神经递质降低的相关性更高。克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和Muribaculaceae与缓解抑郁指数呈正相关。此外，基于KEGG level 3的预测功能显示，CUMS降低了氨基酸的生物合成，PSE处理可以逆转这一趋势。此外，PSE处理显示出更高的碳代谢、核糖体、不同环境中的代谢和ABC转运蛋白富集功能，特别是在低剂量和中剂量PSE处理下(图S3)。

图6. PSE调节抑郁小鼠的肠道菌群。

对实验小鼠进行16S rDNA测序。
(A) α-多样性指数，即Chao指数和Shannon指数，代表各组的丰富度和多样性。
(B)基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示了各组在OTU水平上的β-多样性。
(C)门和属水平上的群落分布。
(D) LEfSe分析的Cladogram图显示，与模型组相比，差异富集的肠道微生物组。LDA得分>4。在所有情况下n＝8。    

图7. 抑郁小鼠肠道菌群与生物学指标的相关性。

通过检测的生化指标对所有测序样本的肠道菌群进行科水平聚类。展示了带有R值的Spearman相关热图。红色/蓝色表示改变的指标与肠道菌群紊乱呈正/负相关。(*)p＜0.05，(*)p＜0.01，(***)p＜0.001。   4PSE对细胞培养的保护作用

通过分别培养大鼠原代星形胶质细胞、小鼠小胶质BV2细胞和小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，验证PSE的抗炎保护作用。将培养物用PSE或地塞米松作为对照预处理3小时，然后用20 ng/mL的LPS激发以诱导炎症反应。LPS诱导的细胞因子表达，即IL-1β、IL-6和TNF-α，在培养物中被PSE以剂量依赖性方式显著抑制，类似于地塞米松(图8A-C)。此外，利用tBHP、谷氨酸、CoCl2和Aβ25-35等细胞死亡诱导剂，模拟培养的皮层神经元的氧化应激、兴奋或缺氧应激。不同诱导剂诱导的细胞毒性均可通过PSE预处理得到抑制，且保护作用呈剂量依赖性(图8D)。PSE浓度为~20 μg/mL时，保护作用最大。这些结果表明，PSE对应激诱导下的神经元和/或免疫细胞具有直接的保护作用。

图8. PSE在体外显示出保护作用。

PSE处理(3至100 μg/mL)3 h后，将LPS(20 ng/mL)应用于(A)培养的星形胶质细胞、(B) BV2小胶质细胞和(C) RAW264.7巨噬细胞。24 h后提取RNA，并通过实时PCR测定IL1-β、IL-6和TNF-α的mRNA水平。10 μM地塞米松为阳性对照。(A-C)中n=3和(D)中n=6。(*)与给予LPS的对照组相比，p＜0.05。(D)在不同剂量的PSE处理后，对培养的大鼠皮层神经元给予不同的毒素。24 h后，通过MTT检测细胞活力来确定其保护作用。      

讨论

本研究旨在证明PSE作为一种天然的、经济的健康补充剂在治疗CUMS诱导的抑郁小鼠中的应用。本研究的行为测试中，强迫游泳和悬尾决定了绝望情绪，而蔗糖消耗和体重分别代表了快感缺乏和植物神经症状的水平。PSE的摄入在行为测试中表现突出，其疗效与使用最广泛的选择性血清素再摄取抑制剂氟西汀相当。许多研究报告了木犀草素和圣草酚的苷配基、轭合物和富集提取物对抑郁症的治疗作用。这些植物化学物质的治疗机制涉及多种机制作用。

例如，木犀草素表现出促进神经发生和神经可塑性的潜力，以及减轻大脑中的内质网应激和炎症。 抑郁症的特征是大脑结构的改变和神经元的丧失。本研究的小鼠模型表明，应激介导的海马损伤可能是由氧化、兴奋性毒性和炎症作用引起的。充分证明木犀草素和/或圣草酚的神经保护特性可能有助于观察到的PSE治疗后损伤的恢复。木犀草素可以渗透血脑屏障，直接调节神经元细胞的各种内在神经保护通路。其保护作用尤其归功于它能够阻断激活的内皮细胞、肥大细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间的恶性循环，尽管确切的上游目标仍不确定。木犀草素的这一特性支持PSE给药后观察到的大脑和循环炎症的减少。

类似地，圣草酚已被证明通过多种机制发挥抗凋亡、抗氧化和抗炎作用，如MAPK、NF-κB、Sirt1和Nrf2/Keap1途径。当前的体外试验进一步验证了PSE的保护作用。细胞培养物中使用的PSE的最大浓度为100 μg/mL，仅包含木犀草素、圣草酚和5,7-二羟基色原酮这三种化合物约5 μM，这表明其他活性成分可能参与了保护作用。 在抑郁小鼠中，PSE的摄入可能通过木犀草素发挥对单胺氧化酶的抑制作用，导致单胺能系统的调节。这种机制类似于第一代抗抑郁药，它会增加突触间隙中神经递质的数量。与木犀草素、芹菜素和白杨素相关的两种黄酮，以及与圣草酚、柚皮素相关的一种黄烷酮，已被证明通过上调5-羟色胺能系统介导抗抑郁作用。

此外，PSE处理后观察到的神经营养因子增加可能是由于木犀草素公认的神经营养特性。木犀草素的摄入通常导致Trk相关级联反应上调，激活下游转录因子，如CREB，进一步促进神经营养因子的表达。木犀草素与TrkB受体激动剂7,8-二羟基黄酮的结构相似性可能是TrkB信号传导增强的具体原因。同时，圣草酚已被证明通过提高GDNF和BDNF的水平来改善运动功能。此外，神经营养因子的高表达可能是对PSE处理后神经传递改善的反馈反应。 HPA轴稳态的破坏与脑损伤、炎症和心血管损伤相互关联。

因此，PSE对HPA活性的调节可能源于某些系统反馈，如炎症减轻。这种压力调节作用支持使用花生壳预防心血管疾病的传统医学实践，这些疾病通常与抑郁症并存。如之前的报道所示，木犀草素对GABA能传递的调节可能有助于减轻HPA轴的过度激活。此外，发现一些与木犀草素和圣草酚有关的黄酮类化合物影响11β-羟基类固醇脱氢酶和糖皮质激素受体的功能；两者都是HPA轴的重要调节因子。 与之前一项关于结肠炎治疗的研究一致，该研究发现PSE可以减少抑郁小鼠的肠道炎症，并修复紧密连接蛋白的完整性。PSE在肠道中的浓度应达到一定水平，因为PSE富含抗氧化物质，以促进直接修复功能。此外，推测木犀草素和圣草酚在这种情况下具有抗氧化和抗炎能力。据报道，这两种化合物通过调节信号通路保护肠道紧密连接蛋白，如MAPK、NF-κB、MLCK、Nrf2和hedgehog。另外，PSE可以通过调节肠道菌群来促进肠道上皮屏障的稳定。

抑郁症患者的肠道菌群多样性通常较低，这既是抑郁症的原因，也是抑郁症的后果。当前的16S rDNA测序表明，PSE改变了肠道菌群的α多样性和β多样性以及微生物群落的组成，包括厚壁菌门/拟杆菌门的比例降低。PSE中发现的多种植物成分可以协同作用，进而带来这些变化，最终改善微生物群代谢和肠道稳态。木犀草素通过抑制病原菌、促进短链脂肪酸的生成和抑制α-葡萄糖苷酶显示出其改善肠道生态失调的潜力。

此外，圣草酚可以通过人体代谢转化为橙皮苷和柚皮素。这些黄酮通常存在于柑橘类水果中，其微生物群调节特性已被广泛报道。例如，一项研究调查了饮食干预对小鼠的影响，结果显示，从柠檬中提取的圣草次苷显著改变了肠道菌群的多样性和几种益生菌的富集。PSE中的其他多酚类化合物往往不被肠道吸收，因此更有可能与肠道微生物直接相互作用，发挥调节作用。此外，纤维等非药用成分可能是毛螺菌科丰度显著增加的原因，正如在PSE处理的小鼠中观察到的那样。已知这种特殊的细菌能够发酵植物多糖，产生有利于肠道健康的短链脂肪酸。同时，纤维已被证明可以与黄酮(如木犀草素)协同作用，改善肠道菌群的整体状况。 本文使用的乙醇提取物PSE与其他报道的PSE相比，具有较低的木犀草素浓度，并附加了专门的制备程序，如脱脂和微孔树脂纯化。尽管如此，有趣的是，当前的PSE在100 mg/kg/天的低剂量下功能良好。

这表明，更低量的PSE也可能有效，其在体内已经属于木犀草素/圣草酚单一化合物的应用剂量范围(10-100 mg/kg/天)。PSE在动物中的卓越效果可能来自于通过更好的吸收或更少的降解来提高这些分子的生物利用度。据报道，PSE使木犀草素的峰值血浆浓度(Cmax)和浓度-时间曲线下面积(AUC)分别增加了4倍和2倍。此外，PSE物质之间的协同作用也很重要。从整体角度来看，PSE的其他成分可能与多酚协同作用治疗抑郁症。已知许多脂质成分，如β-谷甾醇，也可以调节免疫力并缓解抑郁症。 综上所述，基于我们之前对单一化合物木犀草素和体外PSE的研究，本次随访的PSE体内生物学验证证明了PSE治疗抑郁症的可能性。PSE可能通过对神经递质、神经营养因子、应激激素、炎症介质和肠道菌群的全面调节，帮助缓解CUMS诱导的小鼠抑郁行为。PSE的应用促进了农业废弃物的回收利用，使其成为具有高附加值的健康补充剂。