【醉翁之艺】术前肠道菌群在老年骨科手术患者术后神经认知功能障碍中的作用

研究背景

POCD主要指麻醉和手术后发生的记忆力、注意力下降，好发于老年患者。随着我国逐渐步入老龄化社会，接受全麻手术的老年患者亦逐年增多。POCD严重影响患者术后生活质量，延长住院时间，甚至增加发病率和死亡率，给家庭和社会带来巨大压力。因此，探究POCD的发病机制及临床前干预方案迫在眉睫。

多项研究表明，POCD的发病机制、临床表现和中枢神经系统的形态病理改变方面与AD相似。但是，POCD的诊断依赖于认知量表和麻醉医生自身经验，缺乏早期诊断的敏感性。因此，探究POCD生物标志物，制定翔实的诊断指标是临床麻醉研究中亟待解决的关键问题。有研究表明，AD患者肠道菌群的组成和数量与健康对照组存在显著差异。该研究团队前期的基础研究发现，老年小鼠认知功能障碍和肠道微生物群紊乱之间存在关联。但是人类肠道菌群与POCD之间的关系尚无类似研究。该研究探讨了肠道菌群及代谢物在老年骨科患者POCD中的作用，试图寻找老年POCD患者肠道菌群的术前诊断指标。

研究方法

2.1. 临床研究设计

该研究为一项前瞻性病例对照研究，收集行骨科手术的老年患者的粪便样本，比较POCD组和非POCD组患者肠道微生物群和代谢物的变化。该研究经华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会批准，在样本采集前所有患者均签署知情同意书。

入组标准：择期行下肢骨折内固定、全麻膝关节置换术或髋关节置换术患者，ASA分级I - II，年龄66-84岁，围手术期意识清醒。

排除标准：存在中枢神经系统疾病或心理障碍、过去一年内长期使用镇静剂或抗抑郁药、帕金森病、严重的听力或视力障碍、药物依赖、酗酒、无法与医生沟通。

该研究为诊断性试验，采用ROC曲线检验。老年患者POCD的发病率约为40%，将阳性组的样本量设为40%，AUC=0.8，I型误差，α=0.05；II型误差，β=0.1；退出率为20%，因此该研究的阳性样本量为16例，阴性样本量为24例。该研究的总样本量为40例。

2.2. 一般信息采集

术前经患者同意收集必要的一般资料和病史。收集手术期间生命体征、术后疼痛评分及抗生素治疗情况。

2.3. 神经心理评估

术前1天、术后1天、术后3天、术后28天分别对患者进行神经心理评估。通过MMSE、MoCA-B、Mini-Cog量表对患者进行认知功能评估，并根据评估结果将所有受试者分为POCD组和Control组。以上所有评估均由同一麻醉医生完成。

2.4. 粪便DNA提取和PCR

术前1天收集粪便样本(约重2 g)，悬浮于粪便储存液(朗富生物科技有限公司，中国上海)中，快速冷冻保存于- 80°C。按照制造商的说明，使用MagPure Soil DNA LQ试剂盒(Magen，广东，中国)从粪便样本中分离细菌DNA。DNA浓度和完整性分别用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和琼脂糖凝胶电泳测定。

2.5. 16S rRNA基因测序

用凝胶电泳法观察扩增质量。PCR产物用agcourt AMPure XP珠(Beckman Coulter Co.， USA)纯化，用Qubit dsDNA检测试剂盒定量。然后调整浓度进行测序，测序在Illumina novaseq6000上进行，每个测序周期为250个碱基。

原始测序数据采用FASTQ格式。使用切割适应软件对配对端读取进行预处理。使用DADA2 (Callahan et al.， 2016)，默认参数QIIME2 (Bolyen et al.， 2019)对低质量序列进行过滤、去噪、合并，检测并截断嵌合体序列。最后，软件输出代表性读数和ASV丰度表。

2.6. 非靶向代谢组学分析GC-MS和LC-MS

2.6.1.GC-MS 

样品在Agilent 7890B气相色谱系统和Agilent 5977AMSD系统(Agilent TechnologiesInc)上进行分析。加州，美国)。采用ADB-5MS熔融石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm,USA)分离衍生物。以氦气(>99.999%)为载气，以1 ml/min的恒定流速通过柱。 

2.6.2. LC-MS

采用Dionex Ultimate 3000 RS UHPLC，配备Q-Exactive +四极轨道rap质谱仪，配备加热电喷雾电离(ESI)源(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, usa)，分析ESI正离子和ESI负离子模式下的代谢谱。采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(1.8 μm, 2.1 × 100 mm)，模式选择：正负。

2.7 统计分析和生物信息学分析 

采用SPSS 17.0 (SPSS Inc.， Armonk, New York, United States)进行统计学分析。数值以均数±均数标准误差(S.E.M.)表示，组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)+Tukey检验或Fisher确切概率检验。正态分布数据采用单因素方差分析，非正态分布数据采用Fisher确切概率检验。组间差异的比较采用卡方检验和Fisher确切概率检验。通过ROC曲线分析确定诊断截止点、AUC、敏感性和特异性。p值<0.05为有统计学差异。 

采用qiime2软件包选择各ASV的代表性读本。使用带有默认参数的q2-feature-classifier对所有具有代表性的读取进行了注释，并对Silva数据库Version 138 (16s rDNA)进行了分析。利用Chao1指数、Shannon指数和ACE指数组成的α多样性估算粪便样品中微生物的多样性。利用QIIME2软件得到的Unifrac距离矩阵进行非加权Unifrac主坐标分析(PCoA)和系统发育树构建。16S rRNA基因扩增子测序采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)进行多元统计分析，寻找组间代谢物差异。使用配对T检验和Fold变化分析来比较两组之间的代谢物。多维分析和一维分析相结合用于筛选差异代谢物。使用KEGG数据库对差异代谢物进行代谢途径富集分析。OPLS-DA模型第一主成分的筛选标准为VIp值>1, t检验的筛选标准为p<0.05。

研究结果

3.1 一般资料及围手术期临床资料

一般信息和病史列于表1。神经心理评估结果包括所有时间点列于表2。术后疼痛数值评定量表(NRS)列于表3。

4.2. POCD患者的微生物组成

测序后将原始数据进行去重、去背景等一系列降噪处理后，将两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，结果提示有39个ASV和20个属存在显著差异。统计结果提示，在6个水平上相对丰度最高，其中Bacteroidota、Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriota、Fusobacteria在门水平上的丰度最高(图1A)。采用Wilcoxon秩和检验，两组在属水平上的相对丰度差异有统计学意义，包括Alistipes (p = 0.008)、Helicobacter (p = 0.007)、Lysobacter (p = 0.011)、Barnesiella (p = 0.017)、Macrococcus (p = 0.049)等(图1B)。图1C-L列出了前10个差异属细菌的相对丰度。

Chao1多样性指数测定的α多样性提示没有显著统计学差异(p = 0.098)。Shannon指数(p = 0.065)和ACE指数(p = 0.110)表明物种多样性和均匀性也没有显著差异(图2A-C)。基于Bray-Curtis距离算法，通过PCA和PCoA测量发现，两组之间β多样性没有统计学差异。

4.3. 应用ROC曲线分析评价肠道细菌对POCD的诊断价值

采用ROC曲线分析评价POCD患者20种差异属肠道细菌的诊断效率(图3)。POCD组对Helicobacter、Alistipes、Barnesiella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Prevotellaceae_NK3B31_group、Pediococcus的诊断效率均显著高于对照组。曲线下面积(AUC)、p值、肠道细菌诊断POCD的敏感性、特异性见表4。

4.4. 差异代谢物及相关代谢途径

采用GC-MS和LC-MS平台进行非靶向代谢组学分析，两组在PCA、PLS-DA和OPLS-DA代谢谱水平上存在显著差异(R2 = 0.961, Q2 =−0.268;图4A、B)。通过t检验筛选出27种差异代谢物，并在GC-MS平台上通过火山图(图4C、D)和分层聚类进行可视化(图5)，包括乙酸、亮氨酸、焦磷酸盐等(图5)。LC-MS平台共筛选出125种差异代谢物。差异代谢物列在补充材料数据表1和2中。

然后利用KEGG数据库找差异代谢物高度富集的代谢途径。GC-MS平台代谢产物丰度最高的途径为:蛋白质消化吸收、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、mTOR信号通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸肝素/肝素、酒精性肝病、胆碱能突触、志贺菌病、氧化磷酸化、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢(p<0.05, 图6A)。LC-MS平台富集最多的代谢途径为:甘油磷脂代谢、肿瘤中胆碱代谢、胆碱能突触、肌动蛋白细胞骨架调节、不饱和脂肪酸生物合成、尼古丁成瘾、突触囊泡循环、胰岛素分泌、胃酸分泌、胰腺分泌、唾液分泌(p<0.05, 图6B)。

4.5. 微生物组与代谢物的相关性

应用Spearman相关分析肠道菌群与代谢物之间的相关性，结果表明两者之间存在显著相关性。拟杆菌与甲磷硫酸(p = 0.005)、纤毛虫酸(p = 0.002)呈显著负相关，与L-赖氨酸(p = 0.025)、L-丙氨酸(p = 0.040)呈显著正相关。Sutterella与甲磷硫酸(p = 0.003)和纤毛虫(p = 0.002)呈正相关。[Eubacterium]_coprostanoligenes组与5-氨基戊酸(p = 0.0003)、Talose (p = 0.0008)等呈负相关(图7)。

研究结论

老年POCD患者肠道菌群变化及部分属细菌可能是术前预测POCD发病率的有效诊断指标。乙酸、花生酸、焦磷酸盐等差异代谢物在POCD患者认知功能障碍中起重要作用。

醉翁之艺 点评

1、该研究着眼于肠道菌群，探究POCD发病机制及临床可能的生物标志物，是近年来POCD临床研究中比较具有创新性的研究。

2、虽然该研究团队已经筛选出了可能作为POCD指标的差异菌群和代谢物，但尚未进行验证工作   如   粪便微生物群移植等。

3、临床病人存在基因背景差异性，基因背景差异与肠道菌群差异混杂在一起，存在混杂偏倚、仍需扩大样本量进行进一步实验。

4、该研究属于单中心前瞻性病例对照研究，存在样本选择偏倚。

编译：张一哲

审校：苏殿三 原始文献：  

1. Bi J, Xu Y, Li S, Zhan G, Hua D, Tan J, et al. Contribution of preoperative gut microbiota in postoperative neurocognitive dysfunction in elderly patients undergoing orthopedic surgery. Front Aging Neurosci. 2023;15:1108205.

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