科研丨MOL CELL PROTEOMICS: 冷暴露引起的小鼠脑肽组和肠道微生物组的改变与能量稳态有关(国人佳作)

编译：微科盟Esther，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

哺乳动物冷暴露期间的能量稳态涉及复杂的神经调节，并受到肠道微生物群的影响。然而，由于缺乏对相关信号分子的全面了解，其调控机制仍不清楚。本研究使用冷暴露小鼠模型进行了脑肽组的区域可分辨定量分析，并研究了肠道微生物和脑肽在冷反应中的相互作用。在慢性冷暴露期间观察到脑肽组的区域特异性变化，并且与肠道微生物组的组成相关。几种proSAAS衍生多肽与乳杆菌(Lactobacillus)呈正相关，下丘脑-垂体轴对冷暴露表现出敏感反应。本研究获得了可能参与调节冷诱导能量稳态的生物活性肽候选库。对小鼠进行冷适应微生物群的干预降低了下丘脑神经激肽B的丰度，并随后导致能量消耗的能量来源从脂质转移到葡萄糖。综上所述，本研究表明肠道微生物调节有助于能量代谢的脑肽，为了解冷暴露时能量稳态的调节机制提供了数据来源。  

图文摘要  

论文ID

原名：Cold exposure-induced alterations in the brain peptidome and gut microbiome are linked to energy homeostasis in mice

译名：冷暴露引起的小鼠脑肽组和肠道微生物组的改变与能量稳态有关

期刊：Molecular & Cellular Proteomics

IF：7.381

发表时间：2023.3

通讯作者：贾辰熙，杨丹凤

通讯作者单位：国家蛋白质科学中心·北京(凤凰中心)/北京蛋白质组研究中心；天津环境医学与作业医学研究所

DOI号：10.1016/j.mcpro.2023.100525

实验设计

结果

1 慢性冷暴露改变小鼠的摄食行为

本研究分别构建了慢性冷暴露(CCE)和急性冷暴露(ACE)两种小鼠模型。具体而言，CCE组小鼠在12℃下保持28天，ACE组小鼠在室温下保持26天，然后转移到12℃环境中保持最后2天(图1A)。将保持在室温下的小鼠用作对照组(RT组)。28天后，收集每只动物的脑组织用于多肽组学分析，粪便样品用于16S rRNA分析。在实验期间，基于食物摄入和体重的测量，持续监测体内能量稳态的表型数据。

在12℃下暴露28天后，与RT组和ACE组相比，CCE组小鼠的食物摄入量明显增加(图1B)，而与其他两组相比，CCE组小鼠的体重没有变化(图1C)。为了直观地显示增加的情况，计算并绘制了每个时间点CCE/RT和ACE/RT比较中食物摄入量与体重的比率。在实验的第四天，CCE/RT比较中食物摄入显著增加，这种增加在接下来的25天内得以保持，但在ACE/RT比较中食物摄入没有观察到显著增加。在CCE/RT或ACE/RT比较中未观察到体重增加(图S1A、S1B)。哺乳动物体内的能量平衡需要摄入、消耗和储存之间的平衡。在我们的实验中，食物摄入代表能量摄入的主要来源，能量储存主要通过体重变化来体现(图1D)。在CCE组中，能量摄入随冷暴露时间的增加而增加，能量储存没有变化，表明能量消耗显著。因此，慢性冷暴露影响了小鼠的能量稳态，重要的是改变了小鼠的摄食行为。相比之下，急性冷暴露的影响较小。

图1. 冷暴露小鼠的表型变化及脑肽的鉴定。

(A)小鼠冷暴露的工作流程。(B，C)食物摄入量和体重增长量。左图显示时间线，右图显示28天摄食量和体重平均值或累计值。左图使用双因素方差分析，右图使用双尾非配对T检验。**p < 0.01，***p < 0.001。均值±标准差。(D)能量稳态。(E)脑肽在三个区域的分布。条形图显示了每个大脑区域中已鉴定肽(上图)和成熟肽(中图)的数量。存在于多个区域的肽子集在矩阵中标出(下图)。饼图显示了定位于一个、两个和三个脑区的已识别脑肽的百分比。详细信息见补充数据S1。每组10只老鼠，每笼两只。RT：室温；ACE：急性冷暴露；CCE：慢性冷暴露。  

2 多肽组学鉴定了数千种脑肽

为了探索冷暴露如何影响小鼠的脑肽，我们使用1-h LC/MS/MS多肽组学方法来分析海马体、下丘脑和垂体的多肽组。准确的鉴定是大规模定量分析这些信号分子的先决条件。在此，我们将RT组指定为代表性数据集，并从三个区域鉴定了5607个脑肽，包括下丘脑中的1894个，海马中的858个和垂体中的4493个(数据文件S1)。多肽组在不同区域表现出高度动态表达(图S2)。我们绘制了两个区域之间脑肽丰度的差异，大约一半的多肽在大脑两个区域之间的动态范围内显示出超过一个数量级的差异(图S3)。接下来，分析了脑肽在多个区域的共定位(图1E，数据文件S1)。78%的肽只定位于一个区域，15%的肽定位于两个区域，7%的肽定位于所有三个区域。因此，多肽组表达具有区域特异性，区域可分辨定量分析是合适的。

3 冷暴露改变了脑肽组的结构

本研究的结果表明，慢性冷暴露改变了小鼠体内的能量平衡。这一过程涉及复杂的神经循环和神经内分泌调节，其中神经肽和肽激素作为信号因子发挥重要作用。因此，我们对三个脑区中的多肽组进行了无标记定量分析，以研究冷暴露如何影响脑肽组。应用严格的标准来确定可量化的多肽，这导致在下丘脑、海马和垂体中分别定量2171、1118和4031个多肽。三个脑区中多肽组的主成分分析(PCA)显示CCE组与RT组明显分开(图2A、2B、2C)。ACE组显示有分离趋势，但与RT组略有重叠。这一结果表明，冷暴露改变了多肽组结构，特别是在CCE组中。此外，鉴于CCE组和ACE组仅在下丘脑分离，而在其他两个区域不分离，多肽组的改变是脑区域特异性的。为了提供全局视图，我们通过PCA处理了所有多肽组数据，并在图表中绘制了每个组的中心值(图2D)。在冷暴露的作用下，CCE组和ACE组沿着图中心的方向与RT组分开。因此，冷诱导的脑肽组的改变表现出区域特异性属性，并且慢性冷暴露重塑了多肽组。

为了说明冷暴露下脑肽丰度的变化，我们在三个双层火山图中绘制了ACE对比RT和CCE对比RT的多肽组数据集(图2E，2F，2G，数据文件S2)。在海马、下丘脑和垂体中，CCE对比RT的三个火山图分别显示了16、388和328个肽的丰度变化；ACE对比RT的三个火山图分别显示了8、11和45个肽的丰度变化。将CCE对比ACE的多肽组进一步绘制成火山图，显示下丘脑和垂体中分别有212和53个肽发生变化(图S4，数据文件S2)。由于慢性冷暴露，大多数肽在下丘脑和垂体中下调(图2H)。我们进一步将这些改变的肽提交到GO分析中，其中大多数富含激素活性和G蛋白偶联受体结合(图S5)，证明了这些信号因子的功能属性。因此，冷暴露以时间依赖性方式引起脑肽丰度的显著变化，下丘脑和垂体表现出相对敏感的反应。

图2. 冷暴露改变脑肽组组成。

冷暴露下(A)海马、(B)下丘脑和(C)垂体多肽组的PCA图。(D)多肽组的PCA图只显示了每组的中心值，(E)海马、(F)下丘脑、(G)垂体中丰度变化多肽的双层火山图，Benjamini-Hochberg校准的双尾非配对T检验。(H)雷达图显示在冷暴露下丰度变化多肽的数量。每组n = 9或10。详细信息见数据文件S2。CPON：神经肽的C-侧翼肽；MCH：黑色素浓集激素；GLP-1[7-36]：胰高血糖素样肽-1[7-36]。  

4 冷暴露时下丘脑和垂体之间的肽相互关联

下丘脑-垂体(HP)轴是一个重要的神经内分泌系统，在能量代谢中起关键作用。HP轴接收脂肪相关和营养相关信号的输入，然后触发肽激素的分泌，进而调节能量稳态、食物摄入和能量代谢。在此，我们进一步研究了冷暴露后下丘脑和垂体中的脑肽的变化。绘制了两个热图，以显示在CCE组中表现出丰度变化的肽(图3A，3B，数据文件S3)。这些肽大多属于颗粒蛋白和proSAAS家族，与能量代谢和食物摄入有关(图3C)。此外，许多具有重要功能报道的成熟肽在慢性冷暴露后显示表达下调(图3D，3E，数据文件S4)，包括促脂素γ、GLP-1[7-39]、黑色素浓集激素和促肾上腺皮质激素样中叶肽(CLIP)，它们参与能量和葡萄糖代谢的调节。成熟肽被定义为有充分记录的、具有验证生物活性的肽，而不是截短的肽或加工的中间体。为了筛选可能参与冷诱导的能量稳态的候选肽，我们根据二元特异性残基规则将它们归入这些丰度改变的肽(S1，S2表格)。标准包括N-末端-1残基上的K/R和C-末端+1和+2残基上的K/R，或C末端酰胺化+1残基上的G。

HP轴由下丘脑和垂体之间复杂的激素信号级联和相互作用组成，为了研究下丘脑和垂体之间这些信号分子的潜在联系，我们在所有样本中对这两个区域进行了Spearman相关性分析。垂体中的8种成熟肽和下丘脑中的14种成熟肽显示出强烈的正相关或负相关(图3F，数据文件S5)。特别是，脑垂体中的PEN与下丘脑中调节摄食的PEN 19和BIG PEN-LEN高度相关。垂体中的BIG LEN与下丘脑中的大多数肽高度相关，例如具有不同修饰功能的NPY的C侧翼肽、PEN 20、PEN和secretoneurin(图3F)。HP轴介导的能量代谢调节是复杂的，通常需要与来自感觉、昼夜节律和享乐因素等其他信号整合。这些新发现的相关肽对暗示了下丘脑和垂体之间在冷暴露反应的信号因子水平上可能存在相互干扰。

图3. 冷暴露改变了下丘脑和垂体中的多肽组。

热图显示在慢性冷暴露下(A)下丘脑和(B)垂体中丰度变化的多肽。只在CCE组中改变的肽用方框标出。单因素方差分析，p < 0.05。详细信息显示在数据文件S3中。(C)下丘脑和垂体中的前五个肽家族。慢性冷暴露下(D)下丘脑和(E)垂体中丰度变化的成熟肽筛选曲线(CCE/RT的p < 0.05)。Benjamini-Hochberg校准的双尾非配对T检验。详细信息显示在数据文件S4中。(F)热图显示下丘脑和垂体中丰度变化多肽的Spearman相关系数(r)矩阵，至少一种肽的r <-0.6或r > 0.6。每组n=9或10。详细信息显示在数据文件S5中。  

5 冷暴露改变肠道微生物组组成

为了研究冷暴露如何影响小鼠的肠道微生物组，我们对RT、CCE和ACE组粪便样本的16S rRNA数据集进行了比较分析。虽然没有观察到α多样性的变化(图S6A)，但基于加权UniFrac距离(图4A)的β多样性主坐标分析(PCoA)显示，CCE组和ACE组与RT组分离，这表明慢性和急性冷暴露均改变了小鼠的肠道微生物群。根据门水平相对丰度排名前六位的物种累积直方图(图S6 B)显示，厚壁菌门和拟杆菌门通常占据总丰度的93%以上。在不同分类水平上的进一步分析显示，4个细菌科和5个细菌属(图4B、4C，4D，4E)因冷暴露而改变。ACE组显示类似于CCE组的结果。冷暴露降低了乳杆菌科和丹毒丝菌科的相对丰度，而增加了Rikenellaceae和拟杆菌科的相对丰度(图4D)。具有代表性的是，乳杆菌科的丰度从RT组的24.50%下降到ACE组的0.10%和CCE组的0.04%(图4D)，这可以从属水平Lactobacillus的减少中得到证明(图4E)。LEfSe分析进一步证实，微生物组成的丰度，如乳杆菌科和乳杆菌属，在科和属水平上受到冷暴露的影响(图S7、S8)。因此，冷暴露改变了肠道微生物群，即使在12℃下暴露两天也会引起显著变化。

图4. 冷暴露改变肠道微生物组成。

(A)基于加权OTUs的PCoA图显示冷暴露下肠道微生物群的变化。柱状图显示冷暴露对(B)科和(C)属水平微生物组相对丰度的影响。柱状散点图显示了(D)科和(E)属水平上在冷暴露下改变的微生物。双尾非配对T检验。*p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。均值±标准差。每组n=9或10。

6 乳杆菌改变下丘脑中ProSAAS衍生多肽的丰度

当前的数据表明，在冷暴露下，脑肽组和肠道微生物组发生了变化。为了进一步研究脑肽组和肠道微生物群之间的潜在联系，我们使用了5个改变的细菌属与所有样本的脑肽进行Spearman相关性分析。我们获得了19个高度相关的脑肽(图5A、5B，数据文件S5)，包括GLP-1[7-36]、增食欲素B、神经肽Y和神经激肽B，它们与能量代谢有关。值得注意的是，乳杆菌与源于蛋白质前体proSAAS的PEN、PEN 18、PEN 19、PEN 20、GAV和BIG PEN-LEN相关。这些结果表明，ProSAAS衍生的多肽与乳杆菌在代谢过程中存在潜在的联系。受这一发现的启发，我们随后重新分析了我们之前报道的数据集，其中小鼠口服益生菌发酵乳杆菌NS 9。发酵乳杆菌NS 9处理增强了下丘脑中PEN 18、PEN 19和CLIP的表达(图5C)。因此，这些丰度变化的肽与冷暴露下肠道微生物组的变化密切相关，而乳杆菌与proSAAS衍生肽呈正相关。

图5. 乳杆菌改变下丘脑多肽丰度。

(A)热图分别显示下丘脑和垂体中丰度变化的多肽与五个变化的微生物属的Spearman相关系数(r)矩阵。五个微生物属中至少一个属的r<-0.6或r>0.6。详细信息显示在数据文件S5中。(B)散点图分别显示了PEN 18和PEN 19的丰度与乳杆菌相对丰度之间的关系。(C)柱形图显示口服发酵乳杆菌NS 9一个月后PEN 18、PEN 19和CLIP的强度。双尾非配对T检验，* p < 0.05，均值±标准差。每组n = 7或8。

7 冷适应微生物群干预和神经激肽B注射影响代谢过程

为了验证脑肽和肠道微生物对冷暴露的反应之间的潜在联系，我们使用冷适应微生物群(来自CCE小鼠的粪便)来处理小鼠，并测量了能量代谢和脑肽组可能的表型变化。具体而言，小鼠的粪便干预是通过从CCE和RT小鼠获得的粪便灌胃进行的。尽管与RT粪便处理的小鼠相比，CCE粪便处理的小鼠在产热(图6A)和食物摄入量(图S9)方面没有观察到变化，但CCE粪便处理的小鼠在前10小时内显示出更高的RER值(图6B)，表明葡萄糖消耗增加。

在多肽组学实验中，在PRM模式下进行LC-MS/MS分析，对与改变的肠道微生物高度相关的9种下丘脑多肽进行定量分析。与RT粪便处理的小鼠相比，CCE粪便处理的小鼠中神经激肽B的丰度降低(图6C，数据文件S6)，尽管大多数肽的丰度没有变化(图S10)。神经激肽B也逐渐被慢性冷暴露下调(图3D)。这些结果表明，神经激肽B可能与代谢过程的变化有关。为了验证这一假设，我们对小鼠的第三脑室背侧进行了脑室内(ICV)注射神经激肽B。正如预期的那样，注射三小时后RER值下降，但产热没有变化(图6D，图S11)，进一步证实了神经激肽B对慢性冷暴露下从脂质消耗到葡萄糖消耗的变化具有抑制作用。总的来说，我们目前的数据证明了暴露于寒冷环境的小鼠肠道微生物组和脑肽组之间的相互作用及其调节能量稳态的能力。具体来说，本研究的结果表明，适应寒冷的微生物群降低了下丘脑中的神经激肽B水平，从而改变了能量消耗以抵御寒冷环境(图7)。

图6. 粪便干预和神经激肽B注射影响代谢过程。

曲线图显示了RT或CCE小鼠粪便悬浮液处理小鼠的(A)产热值和(B) RER值。RT粪便处理组n=3，CCE粪便处理组n=4。(C)柱状图显示粪便干预后下丘脑中靶肽的变化，n=5，详细信息显示在数据文件S6中。(D)显示经神经激肽B或生理盐水处理小鼠的产热值和RER值的曲线图。曲线图采用重复测量双因素方差分析，柱状图采用双尾非配对T检验。*p<0.05，**p<0.01，ns不显著。均值±标准差。每组n=6只，RER：呼吸交换率。

图7. 在冷暴露下神经肽和微生物群相互作用的示意图。

冷暴露促进小鼠冷适应肠道微生物群的形成，从而抑制下丘脑神经激肽B的表达，并影响能量消耗的能量来源从脂质向葡萄糖的转变。NKB，神经激肽B。

讨论

哺乳动物激活多种代谢过程来维持核心温度以抵御寒冷。越来越多的神经肽和肽激素被发现通过调节能量摄入、储存和消耗之间的动态平衡来参与能量稳态。我们假设在寒冷的环境中调节能量稳态是通过肠道微生物组与脑肽组相互作用来实现。事实上，我们的组学数据集表明，冷暴露以区域特异性的方式重塑脑肽组，一些脑肽与肠道微生物群的组成有关。值得注意的是，几种ProSAAS衍生多肽与乳杆菌呈正相关。小鼠口服冷适应微生物组可降低下丘脑中神经激肽B的丰度，从而影响抵御寒冷的能量消耗。

本研究观察到，在冷暴露后，拟杆菌科的相对丰度增加，而丹毒丝菌科的相对丰度降低。Yang等人使用拟杆菌科典型成员产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)处理小鼠，发现附睾脂肪组织中过氧化物酶体增殖物激活受体 α (PPARα)的mRNA表达水平升高。PPARα激活TGF5的表达，TGF5被胆汁酸激活，进一步刺激能量消耗。此外，之前的一份研究显示，丹毒丝菌科的丰度与肝脏脂肪呈正相关，并受到胃肠胆固醇衍生物的抑制。丹毒丝菌科的几个成员与脂质和葡萄糖代谢受损明显相关，并在患有代谢综合征的老年人中表现出丰度增加。因此，在我们的实验中，拟杆菌科相对丰度的增加和丹毒丝菌科相对丰度的降低可能与调节胆固醇和葡萄糖代谢以维持能量稳态有关。

本研究的结果表明，乳杆菌在冷暴露条件下与PEN、PEN18、PEN19、PEN 20、GAV和BIG PEN-LEN等几种ProSAAS衍生多肽呈正相关。以前的报告表明，这些多肽在调节食物摄入量和体重方面是有效的，并且ICV注射PEN和BIG LEN抗体显著减少了禁食小鼠的食物摄入量。乳酸菌是一种对宿主有积极作用的益生菌，与能量稳态和脂质代谢密切相关。我们进一步发现，口服发酵乳杆菌NS 9增加了下丘脑中PEN 18和PEN 19多肽的丰度。这一新证据表明，肠道微生物可能会影响脑肽，突处了乳杆菌介导的proSAAS衍生多肽变化的潜在途径。

一个重要发现是，小鼠灌胃冷适应微生物群导致下丘脑神经激肽B丰度下降，而注射神经激肽B改变了小鼠能量消耗的能量来源。神经激肽B由Tac2基因编码，在女性生殖调节中起关键作用。尽管靶向三种速激肽受体，但神经激肽B对神经激肽3受体(NK3R)表现出最高的亲和力。神经激肽B-NK3R信号通路对雌性小鼠青春期成熟过程中的代谢困难敏感。Sucquart等人研究了通过NK3R拮抗神经激肽B信号传导对多囊卵巢综合征小鼠模型的影响，证明用NK3R拮抗剂治疗可以改变动物的代谢状态。值得注意的是，他们观察到RER值在总能量消耗没有变化的情况下有所增加。我们在雄性小鼠ICV注射神经激肽B的实验中获得了一致的结果。以前对神经激肽B及其受体的研究主要集中在它们在女性生殖中的功能作用。我们的工作首先证明了神经激肽B在雄性小鼠能量代谢调节中的潜在作用，以及其与生殖的功能相关性，其中的调控机制值得深入研究。

海马体主要在学习和记忆中发挥作用，也在内分泌和神经肽能信号控制的食物摄入中发挥作用。研究发现海马瘦素信号可以控制食物摄入和与食物相关的记忆处理。Sweeney等人确定了一个从腹侧海马到侧隔的厌食神经回路。此外，新出现的证据表明，海马的活动与代谢综合征有关。在本研究的结果中，由于慢性冷暴露后观察到摄食量的增加，海马区多肽的变化可能与冷暴露后的食物摄入量和代谢变化有关。

综上所述，本研究强调了冷暴露时肠道微生物和脑肽之间的相互作用，为解决能量稳态的神经回路和神经内分泌调节以及肠-脑轴的潜在作用提供了有价值的数据支撑。这些新的发现表明，冷适应微生物群和神经激肽B改变了代谢状态，为研究冷诱导的能量稳态机制提供了新的思路。