科研丨江汉大学: 肠道菌群通过免疫调节介导替莫唑胺在胶质瘤中的个体化疗效(国人佳作)

编译：微科盟阿默，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

替莫唑胺(TMZ)是治疗胶质瘤的首选化疗药物。作为第二代烷基化试剂，TMZ在口服类药物中具有较好的生物有效性。然而，低有效率(低于50%)和高耐药率严重限制了TMZ的应用，目前仍然缺乏提高其化疗敏感性的策略。本研究构建了Luci-GL261胶质瘤原位异种移植模型，并结合生物发光成像来评估TMZ的抗肿瘤作用，并区分了TMZ敏感(S)和非敏感(NS)个体。整合微生物组学和代谢组学分析来揭示肠道细菌在TMZ敏感性中的作用。采用Spearman相关分析来探究粪便细菌水平与药效学指标之间的相关性。抗生素处理联合TMZ治疗用于验证肠道菌群参与TMZ反应。采用流式细胞仪分析、ELISA和组织病理学方法探讨免疫调节在肠道菌群介导的TMZ反应中的潜在作用。结果发现，在胶质瘤发展和TMZ治疗过程中，肠道细菌组成发生了显著变化。同时，体内抗癌评估显示TMZ给药后化疗效果有显著差异。此外，16s rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析显示，TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的肠道菌群和免疫浸润状态存在明显差异，而差异肠道菌群及相关代谢物的丰度与TMZ药效学指标显著相关。进一步的验证表明，抗生素处理可加速胶质瘤的发展，减弱TMZ的疗效，抑制免疫细胞(巨噬细胞和CD8α+ T细胞)的募集。综上所述，本研究证实了肠道菌群通过免疫调节参与胶质瘤的发展和TMZ的个体化疗效，因此肠道菌群可作为临床应用TMZ的预测性生物标志物和治疗靶点。  

论文ID

原名：Gut microbiota mediated the individualized efficacy of Temozolomide via immunomodulation in glioma

译名：肠道菌群通过免疫调节介导替莫唑胺在胶质瘤中的个体化疗效

期刊：Journal of Translational Medicine

IF：8.44

发表时间：2023.3

通讯作者：孙宾莲，刘钰晨

通讯作者单位：江汉大学医学部

DOI号：10.1186/s12967-023-04042-5

实验设计

结果

1 多组学研究表明胶质瘤的发展导致小鼠肠道菌群失调  

为了探究肠道菌群在胶质瘤发展中的作用，我们构建了Luci-GL261胶质瘤原位异种移植模型。在第14天时，利用生物发光成像对异种移植模型进行了验证(图1A和附加文件1:图S1)。同时，在第14天时采集对照组和模型组小鼠的粪便样本进行16s rRNA测序分析。

α-多样性指数显示，胶质瘤的发展并没有显著影响微生物群落的丰富度(Chao1、Shannon和Simpson)(附加文件1:图S2)。但是，对照组和模型组之间的β-多样性存在显著差异，这表明胶质瘤的发展导致了肠道菌群结构和组成的失调(图1B)。具体而言，如图1C所示，对照组的优势菌为厚壁菌门(Firmicutes，平均占35.58%)，而模型组中的优势菌为拟杆菌门(Bacteroides，平均占52.16%)。在属水平上，相似性百分比分析结果显示，阿克曼氏菌属(Akkermansia)、双歧杆菌(Bifdobacterium)、Ligilactobacillus等是导致对照组和模型组小鼠之间差异的关键因素(附加证据1:图S3)。此外，KEGG通路富集分析显示，对照组小鼠ABC转运蛋白表达增加，而模型组小鼠聚酮糖单位生物合成、鞘糖脂生物合成、氨基酸代谢等代谢途径增加(p<0.01)(图1D)。

最近的研究已经强调了肠道细菌代谢产物在肠道微生物与宿主相互作用中的重要作用。因此，本研究利用非靶向代谢组学的分析方法，通过比较对照组和模型组粪便样本中的微生物相关代谢物，来探究其在胶质瘤发展中的潜在作用。从LC-MS(+)和LC-MS(-)数据集得出的PCA评分图中，我们观察到QCs紧密聚类，这表明代谢组学方法是稳健可行的(附加问题1:图S4A)。然后建立了OPLS-DA模型来比较两组之间的差异(图1E)。500次迭代的置换检验表明，OPLS-DA模型没有过度拟合(附加问题1:图S4B)。只有满足VIP>1、p<0.05和fold change>2的才被选择进行代谢物注释(图1F)。总共鉴定出64种代谢物，主要包括氨基酸、短链脂肪酸(SCFAs)、脂肪酸、胆汁酸、二肽等(附加项1:表S1)。此外，KEGG富集分析强调了对照组和模型组之间的色氨酸/谷氨酸代谢、亚麻酸代谢、脂肪酸生物合成途径水平不同(附加报告1:图S4C)。综上所述，多组学研究表明，在胶质瘤的发展过程中，肠道菌群有很大的变化。

图1. 胶质瘤诱导小鼠肠道菌群及相关代谢产物生态失调。

A，模型组小鼠胶质瘤原位异种移植模型构建及模型组小鼠第14天的代表性生物发光图像(BLI)。B，采用加权wilcox评价对照组和模型组肠道菌群的β多样性指数。C，对照组和模型组细菌在门和属水平上的分类分布。D，对照组和模型组小鼠肠道菌群不同丰度的KEGG通路。E，基于LC-MS (+) (R2X= 0.242, R2Y= 0.967, Q2=0.69)和LC-MS (-) (R2X=0.491, R2Y=0.801, Q2=0.629)数据的OPLS-DA评分图。F，对照组与模型组间LC-MS(+)和LC-MS(-)差异代谢物的火山图，其fold change>2，p<0.05。  

2  TMZ 治疗改变了肠道菌群分布并增加了其多样性

鉴于观察到了肠道菌群失调与胶质瘤之间的联系，本研究接下来探究了TMZ治疗(胶质瘤的标准化疗策略)对小鼠肠道菌群的影响。收集TMZ治疗前(模型组，第14天收集)和治疗后(TMZ，第21天收集)小鼠的粪便样本，分别进行16s rRNA测序和代谢组学分析(图2A)。与之前报道的结果一致，TMZ治疗逆转了胶质瘤引起的肠道菌群失调。TMZ治疗后，α-多样性指数(Chao1、Shannon和Simpson)显著升高(p<0.001)，表明微生物群落的丰富度和多样性升高(图2B)。同时，两组间β-多样性也存在显著差异(p<0.01)(图2C)。在门水平上，TMZ小鼠以厚壁菌门(Firmicutes)为主(平均占52.04%)，而模型组以拟杆菌门(Bacteroides)为主(附加案例1:图S5A)。具体来说，包括阿克曼氏菌属(Akkermansia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)等17个细菌属的丰度在模型组小鼠和TMZ组小鼠之间存在显著差异(附件1:图S5B、C)。此外，KEGG通路富集分析显示，氨基酸、脂质、葡萄糖和核苷酸代谢活性在两个集群之间存在差异(附件1:图S6)。

粪便样本的非靶向代谢组学分析进一步表明TMZ治疗后肠道菌群代谢谱发生了变化(图2D)。QC样本在PCA评分图中很好地聚类(附加项1:图S7A)，置换检验(500次)表明模型没有过度拟合(附加项1:图S7B)。在模型组和TMZ组之间，包括氨基酸、寡肽、胆酸、短/长链脂肪酸代谢的61种代谢产物最终被注释为显著差异代谢物(VIP > 1, p < 0.05，fold change> 2)(附加项1:表S2)。这些数据证实，TMZ逆转了由胶质瘤原位异种移植引起的肠道菌群失调，并增加了肠道菌群多样性。

图2. TMZ给药导致肠道菌群分布发生显著变化。

A，胶质瘤原位异种移植模型的构建及TMZ治疗。B，TMZ治疗前(Model)和治疗后小鼠肠道菌群α-多样性指数(Chao1、Shannon和Simpson)。C，用加权wilcox评价模型组小鼠和TMZ治疗小鼠肠道菌群的β多样性指数。D，基于LC-MS (+) (R2X=0.262, R2Y=0.972, Q2=0.798)和LC-MS (-) (R2X=0.642, R2Y=0.867, Q2=0.708)数据的OPLS-DA评分图。E，模型小鼠和TMZ治疗小鼠间LC-MS(+)和LC-MS(-)差异代谢物的火山图，其fold change>2和p<0.05。  

3 TMZ敏感和非敏感个体给药前粪便样本中的肠道菌群结构和代谢物显著不同  

作为胶质瘤化疗的一线策略，TMZ反应的高度异质性是部分患者预后不良的原因。最近的研究表明，包括MGMT突变、肿瘤免疫微环境、炎症体、PI3K/Akt通路等在内的多种因素可影响TMZ的个体化疗效，但目前尚缺乏提高化疗敏感性的策略。我们的研究结果充分证实了肠道菌群在胶质瘤的发展和TMZ治疗中的作用。然而，肠道菌群是否能够介导荷瘤小鼠对TMZ的敏感性仍然未知。因此，本研究随后构建了Luci-GL2611胶质瘤原位异种移植模型(第7天)，小鼠在肿瘤注射后第7天随机分为模型组(n=10)和TMZ组(n=40)(图3A)。肿瘤发展和TMZ治疗均导致荷瘤小鼠体重显著下降(图3B)。根据肿瘤抑制率(相对总flux=第21天Flux/第14天Flux)，将TMZ治疗小鼠分为TMZ敏感组(S组，抑制率>30%，n=13)和TMZ非敏感组(NS组，抑制率<-200%，n=14)。如图3C所示，TMZ治疗在S组和NS组抗肿瘤效果上有显著差异。同时，TMZ S小鼠的肿瘤转移和Ki67水平也明显受到抑制(图3D)。这些结果证实了TMZ在一些接种传统TMZ抗性GL261细胞个体中是有效的，表明其他关键因素也影响了TMZ的效果。随后，我们对S组和NS组给药前的粪便样本进行了16s rRNA基因测序分析和非靶向代谢组学分析，以探讨肠道菌群及相关代谢产物是否与TMZ治疗胶质瘤的敏感性有关。我们发现，S组和NS组之间的α-多样性(Chao1、Shannon和Simpson)无显著差异(图4A)，而用β-多样性指数分析结果表明肠道菌群分布具有显著差异(图4B)。进一步分析发现，NS个体中Bacteroides的丰度(59.05%)明显高于S组(38.97%)(附件1:图S8A)。这一结果与模型组Bacteroides丰度(52.16%)高于对照组(33.54%)相一致(图1C)。进一步的筛选显示，S组和NS组小鼠肠道菌群中阿克曼氏菌属(Akkermansia)、Alloprevotella、Muribaculum、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的丰度差异最大(图4C和附件1:图S8B)。同时，代谢组学分析显示，与肠道微生物相关的代谢水平存在显著差异(附加报告1:图S9A, B和图4D)。基于KEGG通路的功能预测也表明，S组和NS组小鼠给药前的粪便样本之间的色氨酸代谢、类固醇生物合成和鞘脂代谢水平存在显著差异(附加文件1:图S9C)。Spearman相关分析表明，粪便样本中变化细菌的丰度与代谢物之间存在显著相关性(附加报告1:图S10)。随后的分析显示，差异肠道菌群和代谢物的丰度与药效学评价指标显著相关(图4E和附件1:图4E:S11)。简而言之，本部分揭示了TMZ敏感和非敏感个体的肠道菌群具有不同的分布特征和功能，而肠道细菌在TMZ疗效中的潜在作用机制仍需进一步探究。

图3 TMZ敏感(S)和非敏感(NS)个体的识别。

A，胶质瘤原位异种移植模型构建及TMZ治疗流程。B，胶质瘤发展和TMZ给药对小鼠体重的影响。采用相对总通量(第14天Flux/第7天Flux)和对TMZ S (n=13)和NS (n=14)小鼠的肿瘤抑制率评价TMZ的疗效。D，S和NS小鼠的代表性照片、BLI图像、HE染色和免疫组化(Ki67)。

图4 不同的肠道菌群分布和代谢产物可能有助于个体化TMZ疗效。

A，TMZ S和NS小鼠肠道菌群α-多样性指数(Chao1、Shannon和Simpson)。B，采用加权wilcox评价TMZ S和NS个体肠道菌群β多样性指数。C，在S和NS小鼠之间细菌属发生显著变化。D，基于LC-MS (+) (R2X=0.236, R2Y=0.794, Q2=-0.522)和LC-MS (-) (R2X=0.475, R2Y=0.808, Q2=0.569)数据的OPLS-DA评分图。E，TMZ治疗后药效学指标与变化细菌属/代谢物丰度的Spearman相关系数热图。颜色的强度表示药效学指标水平与变化的细菌属/代谢物丰度之间的关联程度。p值<0.05认为有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01。

4 对TMZ治疗反应不同的小鼠免疫浸润有显著差异

肠道菌群可通过免疫系统调节介导疾病的发展和药物反应。众所周知，免疫逃逸是胶质瘤的特征之一。我们推测肠道细菌通过免疫调节来影响TMZ敏感性。因此，我们分别在第21天收集TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的血清，测定其IL-1β和TNF-α浓度。如图5A所示，敏感个体的IL-1β和TNF-α水平明显升高，表明胶质瘤诱导的免疫抑制在敏感小鼠中被逆转。为了进一步证实这一推测，我们采用免疫组织化学方法评估了第21天巨噬细胞(F4/80)和细胞毒性T淋巴细胞(CD8α)的浸润程度。虽然对照组和模型组小鼠之间没有明显变化(图5B)，但在TMZ敏感小鼠的大脑和肿瘤组织中，巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞的百分比明显更高(图5C)。综上所述，我们的研究表明TMZ敏感个体的免疫浸润增强。

图5 TMZ敏感和非敏感小鼠免疫浸润的差异。

A，S和NS小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的变化。对照组、模型组(B)、S组和NS组(C)小鼠CD8α、F4/80免疫组化和定量分析，p值<0.05认为有统计学意义，*p<0.05。  

5 ABX给药抑制了TMZ的疗效和免疫细胞的募集

在确认TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠肠道菌群结构和免疫浸润的差异后，我们想进一步研究肠道菌群在个体化TMZ敏感性中的作用。广谱抗生素鸡尾酒(ABX)，由氨苄西林、甲硝唑、硫酸新霉素和万古霉素组成的经典抗生素组合。ABX已被广泛认为足以耗尽所有可检测到的共生细菌。因此，采用ABX处理来根除荷瘤小鼠的肠道菌群(图6A)，ABX处理如预期那样导致小鼠体重的进一步下降(图6B)。后续对TMZ在治疗有/无肠道菌群的小鼠肿瘤的评估结果显示，ABX略微促进了胶质瘤的发展(p>0.05)，而TMZ疗效显著减弱(p<0.05)(图6C, D)。同时，肠道菌群缺失后，肿瘤的侵袭能力和Ki67水平明显升高(图6E)。这些结果证实了肠道细菌参与胶质瘤的发展和TMZ抗胶质瘤的功效。

此外，免疫组化显示ABX联合后(TMZ vs ABX-TMZ)脑和肿瘤组织中巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞的募集减少(图7A)。流式细胞仪分析结果显示，TMZ治疗后大脑中巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞的募集增加(模型vs TMZ)，而ABX联合TMZ治疗肿瘤后巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞水平下降(ABX-模型vs ABX-TMZ)，表明肠道菌群确实通过免疫调节介导了TMZ的疗效(图7B)。综上所述，微生物组学与代谢组学相结合证明，肠道菌群可通过免疫调节影响胶质瘤原位异种移植模型的TMZ个体化疗效。

图6 广谱抗生素(ABX)处理对TMZ疗效的影响。

A，ABX处理实验流程。B，TMZ和ABX给药对小鼠体重的影响。C，各组小鼠总通量变化。D，相对总通量(第14天Flux/第7天Flux)评价化疗疗效。E，各组小鼠代表性照片、HE染色及免疫组化(Ki67)。 

图7 广谱抗生素(ABX)治疗对荷瘤小鼠免疫浸润的影响。小鼠F4/80和CD8α的免疫组化(A)和流式细胞仪分析(B)。  

讨论

替莫唑胺作为胶质瘤的一线化疗方案，在治疗胶质瘤方面已显示出优于单纯放疗的优势。然而，TMZ相对较低的有效率限制了其治疗效果，影响了患者的预后。因此，揭示影响TMZ化疗效果的潜在关键因素至关重要。在本研究中，我们发现在胶质瘤发展和TMZ治疗期间，肠道菌群发生了显著变化。同时，胶质瘤原位异种移植模型对TMZ治疗表现出明显的敏感性。我们发现TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的给药前粪便样本中的肠道细菌分布和免疫浸润水平具有显著差异。此外，ABX处理进一步证实了肠道菌群介导的免疫调节在个体化TMZ疗效中的作用。综上所述，我们的研究表明肠道菌群通过免疫调节影响TMZ的个体化疗效(图8)。

图8 肠道菌群通过免疫调节介导TMZ个体化疗效的示意图。  

与之前的研究一致，本研究发现胶质瘤的发展和TMZ治疗都能够影响小鼠肠道菌群分布特征和相关代谢产物(图1、2)，这表明肠道菌群在胶质瘤病理进展和TMZ治疗反应中起着至关重要的作用。了解肠道菌群在TMZ治疗中的潜在机制是很有趣的。我们的研究发现，TMZ在高达30%的患TMZ耐药胶质瘤的小鼠(GL261细胞)中仍然有效(图3)，这表明TMZ的功效还涉及其他关键因素。因此，我们分析了敏感小鼠和非敏感小鼠的肠道微生物分布特征和代谢水平。我们发现两组之间的肠道菌群结构显著不同。并且肠道差异菌群及相关代谢产物的丰度与TMZ的药效学评价显著相关(图4)。进一步的实验表明，ABX预处理可显著减弱TMZ的抗肿瘤作用，证实了肠道菌群对TMZ个体化疗效的关键作用。越来越多的证据表明肠道菌群异质性的存在及其在化疗中的作用。本研究的结果支持胶质瘤发展的现象以及对TMZ治疗的个体化敏感性。

众所周知，肠道菌群可通过免疫调节间接影响化疗。炎症通路如NF-κB通路、STAT3信号通路等以及相关炎症因子(ILs、TNFs、IFNs等)在肠道细菌介导的宿主免疫反应中都起着重要的作用。特别是，已知IL-1β和TNF-α是肠-脑轴相互作用的重要介质。本研究观察到了TMZ S和NS个体血清中炎症因子(IL-1β、TNF-α)水平的差异。在脑组织和肿瘤中，巨噬细胞和CD8+ T细胞等免疫细胞的存在也有所不同(图5)。这些结果证实了肠道微生物群通过免疫调节影响TMZ的治疗效果。进一步的研究表明，ABX处理降低了胶质瘤荷瘤小鼠的免疫浸润，从而逆转了TMZ的抗肿瘤作用(图7)。这些数据有力地证明了免疫系统参与了肠道细菌介导的TMZ个体化反应。

肠道菌群代谢产物能够反映肠道微生物，并且在肠道微生物与宿主相互作用中发挥关键作用。在本研究中，基于KEGG通路的功能预测表明，S组和NS组之间的色氨酸代谢水平存在显著差异(附加报告1:图S9)。先前的研究已经证实，肠道菌群可以将膳食中的色氨酸转化为色胺、犬尿氨酸和吲哚衍生物。色氨酸及其相关代谢产物是塑造免疫微环境来影响胶质瘤发展的关键微环境因子。具体来讲，肠道菌群可以通过IDO1将色氨酸转化为犬尿氨酸。犬尿氨酸和IDO1均被认为是机体免疫稳态的重要调节因子。AHR作为细菌吲哚和犬尿氨酸的重要传感器，在细菌介导的肿瘤免疫微环境中也起着关键作用。同时，Yang等人证实色氨酸代谢酶色氨酸羟化酶1可通过5-羟色胺/L1CAM/NF-κB信号通路促进胶质瘤的发展。基于色氨酸代谢与胶质瘤发展及TMZ疗效之间的显著相关性(附加file 1:图S9, S4C和图4E)，我们推测IDO1和AHR是细菌色氨酸代谢的潜在靶点。本研究的初步结果显示，对照组小鼠的AHR水平明显高于模型组小鼠；与非敏感个体相比，TMZ敏感小鼠的AHR水平也有所增加(附加研究1:图S12)。这些结果表明，改变的色氨酸代谢物可能参与胶质瘤的发展和TMZ的疗效。但肠道微生物衍生色氨酸及其相关代谢物在TMZ疗效中的生物学功能及其潜在机制有待进一步研究。

本研究强调了肠道菌群和相关免疫调节在TMZ治疗的个体化反应中的重要作用。因此，肠道菌群对TMZ疗效的作用需要基于临床样本和患者来源的异种移植模型进一步验证。同时，本研究首次在敏感小鼠和非敏感小鼠之间鉴定出了4个具有显著差异的细菌属，因此探究这4个差异细菌类群移植对TMZ抗肿瘤作用的影响是很有意义的。此外，本研究仅证实了免疫调节参与肠道菌群介导的TMZ疗效，但其潜在机制有待进一步研究。

综上所述，本研究确定了肠道菌群在TMZ抗癌作用中的关键作用。特别是，TMZ敏感和非敏感个体之间的肠道菌群分布特征和免疫浸润存在差异。此外，ABX处理加速了胶质瘤的发展，逆转了TMZ的抗肿瘤作用，加重了癌症引起的免疫抑制。本研究揭示了肠道菌群通过免疫调节参与个体化TMZ疗效，因此肠道菌群可能作为胶质瘤治疗的预测性生物标志物或治疗靶点。阐明肠道微生物群及其代谢物的各自作用可能为在胶质瘤治疗中使用替莫唑胺进行精准医学干预提供机会。