科研丨首医大: 综合分析揭示轻度和重度手足口病儿童肠道和口咽微生物群的重要差异(国人佳作)

编译：微科盟如风，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读

目前人们对轻度和重度手足口病(HFMD)患者肠道菌群的变化和差异知之甚少。本研究调查了轻度和重度手足口病儿童肠道和口咽微生物群的差异，以及随着疾病从急性期进展到恢复期细菌谱的变化。对42例确诊手足口病患者进行了研究，其中重症32例，轻症10例。所有患者在症状出现后平均2天(急性期)采集第1次直肠拭子，8名重症患者在症状出现后第9天(恢复期)采集第2次直肠拭子。从10名急性期患者和6名恢复期患者中获得口咽拭子。对所有70份样本进行16S rRNA测序。与轻度手足口病相比，重度手足口病的肠道菌群多样性和丰富度显著降低。在急性期和恢复期观察到的肠道微生物群细菌谱彼此相似，但与轻症病例不同。此外，50%的急性期重症手足口病患者携带优势致病菌属。然而，轻度手足口病患者均未携带此类细菌。在轻症和重症病例的口咽微生物群中检测到相似的细菌组成。本研究结果表明，重症手足口病表现出肠道微生物群多样性明显受损，以及肠道和口咽部炎症诱导细菌频繁出现。然而，由于本研究受试者数量有限，应谨慎解释结果。

论文ID

原名：Integrated analysis reveals important differences in the gut and oropharyngeal microbiota between children with mild and severe hand, foot, and mouth disease

译名：综合分析揭示轻度和重度手足口病儿童肠道和口咽微生物群的重要差异

期刊：Emerging Microbes & Infections

IF：19.568

发表时间：2023.3

通讯作者：何秋水

通讯作者单位：首都医科大学；芬兰图尔库大学

DOI号：10.1080/22221751.2023.2192819

实验设计

结果

1、人口统计学数据和病原学调查结果

患者年龄范围为12至36个月，中位年龄为26个月(表1)。男女性别比例为22:20。32例重症手足口病患者中，EV-A71阳性17例，CV-A16阳性3例，普通肠道病毒阳性10例。在10名轻度手足口病患者中，只有1名CV-A16阳性。所有重症手足口病患者均住院治疗，病情达到临床治愈标准后出院。

表1.纳入研究的手足口病(HFMD)患者的人口统计学特征。

2、重度和轻度手足口病患者的肠道细菌谱

本研究共生成3,904,495个tags，并聚类成14,438个OTU。结果显示，所有患者的直肠拭子样本共注释出37门、64纲、97目、152科、330属、259种。

PCoA清楚地显示轻症患者和重症患者的肠道细菌组成明显不同(图1(a))。然而，患者急性期和恢复期的细菌谱有重叠，表明重症和轻症患者的细菌谱不同，而急性期和恢复期细菌谱相似。

轻度手足口病患者的肠道菌群以厚壁菌门(RA：65.8%)、梭菌目XI科(RA：42.0%)及其Ezakiella属(RA：15.1%)、Peptoniphilus属(RA：9.8%)、Finegoldia(RA：7.9%)和Anaerococcus(RA：7.6%)为主(图1(b,c))。这些细菌被认为是产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌。急性期和恢复期患者的肠道菌群组成相似。在属水平上，重症急性期的肠道菌群以Enterococcus(RA：15.8%)、Prevotella(RA：12.3%)、Bacteroides(RA：10.3%)和Escherichia-Shigella(RA：8.9%)为主。此外，重症恢复期的肠道菌群以Enterococcus(RA：32.7%)、Bacteroides(RA：8.9%)、Prevotella(RA：6.2%)和Parabacteroides(RA：4.6%)为主。

LEfSe分析结果表明，重症患者急性期肠道菌群中富集变形菌门(RA：3.0、13.4和1.9%，p = 0.031)，肠杆菌科(RA：1.3、9.8和0.5%，p = 0.041，p = 0.027)，Escherichia-Shigella属(RA：1.2、8.9和0.5%，p = 0.037)及Escherichia coli(RA：1.2、8.9和0.5%，p = 0.037)(图1(d))。此外，重症患者肠道菌群中拟杆菌科(RA：1.1、10.3和8.9%，p = 0.002)、拟杆菌属(RA：1.1、10.3和8.9%，p = 0.002)及物种脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilisRA：0.5、4.5和6.4%，p = 0.006)也显著增加。重症患者急性期肠道菌群中也有丰富的Moraxellaceae科及其Acinetobacter属和Erysipelotrichaceae科及其Erysipelatoclostridium属(p = 0.029，p = 0.021)。功能预测分析还表明，脂多糖(LPS)的生物合成在急性期显著增加。

LEfSe结果还表明，轻症患者的肠道微生物群中富集梭菌目XI科(RA：42.0、15.7和7.7%，p = 0.001，p< 0.001)及其Ezakiella属(RA：15.1、6.6和4.3%，p = 0.039)、Peptoniphilus(RA：9.8、3.0和1.4%，p = 0.005，p = 0.001)、Anaerococcus (RA：7.6、4.2和1.1%，p = 0.002， p = 0.011)和Finegoldia(RA：7.9、1.2和0.4%， p = 0.008)，以及Prevotella bivia(RA：5.9、4.3和0.1%，p = 0.039)和Prevotella corporis(RA：4.1、0.6和0.1%，p = 0.031)，而在重症病例中，它们在急性期和恢复期就已耗尽。恢复期肠道菌群中肠球菌科(RA：1.2、15.8和32.8%)及其肠球菌属(Enterococcus RA：1.2、15.8和32.7%)较急性期和轻症患者显著增加(p = 0.007，p = 0.045)。同时，厚壁菌门(RA：59.0%和65.8%)、拟杆菌门(RA：27.0%和30.2%)和变形菌门(RA：1.9%和2.9%)的RA恢复到轻症患者的水平。因此，重症患者恢复期肠道菌群的细菌组成在一定程度上与轻症患者相同。

图1

手足口病(HFMD)患者肠道菌群的细菌组成。(a)轻度和重度手足口病患者的主坐标分析。对于重症手足口病患者，包括在急性期和恢复期采集的样本。显示了在门(b)、科(c)和属(d)水平上的优势细菌分布。

3、重症患者肠道菌群多样性和丰富度明显降低

与轻症患者相比，重症患者急性期和恢复期alpha多样性指数均显著降低(p值均<0.05)。具体而言，观察到的物种、Chao1和ACE的丰富度指数在急性期呈下降趋势(分别为p = 0.048、p = 0.044和p = 0.037；图2(a-c))。此外，与急性期相比，恢复期Shannon和Simpson两项均匀度指数均显著降低(分别为p = 0.033、p = 0.045；图2(d,e))。这可以归因于梭菌目XI科及其属Ezakiella、Peptoniphilus、Anaerococcus和Finegoldia以及普雷沃菌科及其属普雷沃氏菌属(Prevotella)的显著且持续减少。

图2

轻度和重度手足口病患者肠道微生物群的α多样性。对于重度手足口病患者，包括在急性期和恢复期采集的样本。(a–e)分别为观察到的物种、Chao 1、基于丰度的覆盖率估计(ACE)、Shannon指数和Simpson指数。两组之间的统计学显著差异已标出，*表示p < 0.05。

4、重症患者携带肠道菌群中的优势菌属

当一个菌属占样本中reads> 40%时，它被定义为优势菌属。基于最丰富的属，我们发现50%(n = 16)的重症病例在急性期有优势细菌，包括Enterococcus(n = 5，第1组)、Bacteroides(n = 4，第2组)、Prevotella (n = 3，第3组)、Escherichia-Shigella(n = 2，第4组)、Erysipelatoclostridium(n = 1)和Acinetobacter(n = 1)(图3(a,b))。同时，50%(n = 4)的重症病例在恢复期携带优势细菌属，包括Enterococcus(n = 3，第1组)和Bacteroides(n = 1，第2组)，而轻症病例均未携带上述优势菌属。急性期或恢复期与轻症病例之间优势细菌的病例数有统计学差异(p = 0.001, p = 0.011)。

图3

每个样本的肠道细菌组成。(a)每个样本在属水平上的肠道细菌组成。(b)基于每个样本在门水平的加权UniFrac距离的树。不同颜色的箭头代表不同的优势细菌，对应不同的组。

5、EV-A71、CV-A16和其他肠道病毒感染患者的肠道细菌谱

分析了由EV-A71和CV-A16引起的手足口病患者肠道菌群的组成和丰富度。感染EV-A71的患者富含变形菌门、肠杆菌科、Escherichia-Shigella属和大肠杆菌(所有LDA > 3；补充图1)，而感染CV-A16的患者富含肠球菌科细菌，梭菌目XI科细菌减少(所有LDA > 3)。感染其他肠道病毒的患者表现出与感染EV-A71的患者相似的细菌谱。此外，功能预测分析表明，LPS生物合成在感染EV-A71的患者中显著富集。

6、重度和轻度手足口病患者口咽细菌组成

PCoA不能区分轻症和重症病例以及重症患者急性期和恢复期的细菌谱(图4(a))，这表明三组患者的口咽微生物群组成相似。厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)分别占序列的94.6%、94.0%和93.0%，是丰度最高的三个门(图4(b))。链球菌科及其Streptococcaceae属(RA：28.0、19.0和33.4%)、普雷沃菌科及其属Prevotella_7(RA：10.2、21.3和17.5%)、Veillonellaceae及其Veillonella属(RA：12.9、17.1和15.5%)、Neisseriaceae及其Neisseria属(RA：9.3、5.8和4.4%)、Pasteurellaceae科及其Haemophilus属(RA：7.2、2.5和1.1%)是这三组的优势科和优势属(图4(c,d))。总体而言，Streptococcus、Prevotella和Veillonella分别占三组序列的51.1%、57.4%和66.4%。

LEfSe结果显示，与急性期和恢复期的重症病例相比，轻症患者的口咽微生物群中Bacilli、Bacillales、Family_XI、Streptococcus和Gemella显著富集(所有LDA> 3)。在急性期，Clostridia(p= 0.009)、Clostridiales (p = 0.009)、Megasphaera (p = 0.038)、Lachnospiraceae(p= 0.026)、Ruminococcaceae(p = 0.024)和Alloprevotella(p = 0.028)，以及它们的物种与轻症病例相比明显增加。与轻症病例相比，恢复期Clostridia(p = 0.018)、Clostridiales(p= 0.018)和Streptococcus_salivarius(p = 0.026)显著富集。三组之间的多样性和丰富度没有显著差异。急性期患者B16富集黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、其属Stenotrophomonas (RA: 5.1%)及其物种Pseudomonas geniculate(RA: 50.5%)。

图4

手足口病(HFMD)患者口咽微生物群的细菌组成。(a)轻度和重度手足口病患者的主坐标分析。对于重症手足口病患者，包括在急性期和恢复期采集的样本。显示了门(b)、科(c)和属(d)水平的优势细菌分布。  

7、在重症手足口病患者口咽菌群中观察到的优势菌属

6例患者(B1、B11、B12、B16、B20和B31)在急性期和恢复期提供了口咽拭子(表1)。其中，急性期的两名患者(B16和B31)分别以Stenotrophomonas和Prevotella_7为主。2例恢复期患者以链球菌(Streptococcus)为主(图5(a,b))。值得注意的是，两例患者急性期肠道菌群也以Enterococcus和Acinetobacter为主，恢复期肠道菌群均以Enterococcus为主。

图5

每个样本的口咽细菌组成。(a)每个样本在属水平上的细菌组成。(b)基于每个样本在门水平的加权UniFrac距离的树。不同颜色的箭头代表不同的优势细菌，对应不同的组。

8、肠道和口咽微生物群之间的相关性

分别在急性期和恢复期收集了6名住院患者的直肠和口咽拭子。因此，我们通过分析配对收集的样本，研究了肠道和口咽微生物群中优势细菌之间的相关性。我们在两名患者(B16和B31)的急性期和恢复期的肠道和口咽部发现了优势细菌。在患者B16中，在急性期，Stenotrophomonas和Acinetobacter分别在口咽和肠道中占优势(图6(a))。而在恢复期，B16和B31口咽菌群以Streptococcus为主，肠道菌群以Enterococcus为主(图6(b))。系统发育分析显示，Stenotrophomonas、Acinetobacter、Enterococcus和Streptococcus分别来源于同一个共同起源(图6(c))。

图6

患者B16和B31携带的优势细菌示例。(a)患者B16和B31在急性期和恢复期肠道和口咽部携带的优势细菌。(b)两名患者携带的优势细菌的系统发育树。

讨论

本研究发现，重症病例表现出SCFA产生细菌减少，并且更多地以炎症诱导细菌为主。这些细菌包括肠道中的大肠杆菌、脆弱拟杆菌、肠球菌、普雷沃氏菌、Erysipelatoclostridium和Acinetobacter，以及口咽部的Streptococcus、Prevotella和Stenotrophomonas。我们还成功绘制了中国手足口病儿科患者的肠道和口咽微生物群谱。据我们所知，这项研究首次显示了手足口病患者肠道和口咽微生物群的细菌组成的动态变化。

一项流行病学研究报告，轻症病例很少或没有发展为重症病例，而重症病例通常进展迅速，导致某些病例在症状出现后1-3天内死亡。这表明轻度和重度手足口病病例可能相互独立，并且具有不同的病因和潜在机制。我们的结果部分证实了这一结果。本研究结果表明，重症手足口病患者的肠道微生物组成发生了显著变化，特别是在急性期。与轻度手足口病相比，所观察到的生态失调的特点是致病菌和炎症诱导细菌过度生长，以及产丁酸盐的细菌减少。与健康个体相比，手足口病患者也观察到了这些特征性变化。肠杆菌科微生物的过度生长可能导致大量LPS的释放。LPS的增加与轻度粘膜炎症有关。这主要是由于肠道屏障完整性被破坏及其通透性的增加，从而促进了微生物的易位。先前的数据证实，EV-A71通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶信号通路在肠上皮细胞中感染和复制。这种炎症途径与细菌LPS或易位引起的炎症反应重叠。这与我们的结果一致，即EV-A71感染患者肠杆菌科丰富。Enterococcus也与肠道通透性受损和促进微生物易位有关。特别是，它可以通过产生明胶酶来诱导更高的肠道炎症易感性，明胶酶是一种破坏上皮屏障的金属蛋白酶。Enterotoxigenic B. fragilis(ETBF)可以产生肠毒素并诱导促炎细胞因子的释放，例如白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和CXC激发配体(CXCL)-8。此外，ETBF可以增加Th17淋巴细胞的水平，增强STAT-3依赖性Th17免疫反应。已证明B. fragilis和Enterococcus faecalis可以产生活性氧，从而导致肠道上皮细胞DNA氧化损伤和炎症。随后，包括LPS和多糖A在内的微生物产物与诱导的细胞因子一起穿过受损屏障进入宿主的血液循环，从而引起全身性炎症。这就是为什么重症手足口病患者通常表现出“细胞因子风暴”的原因之一。事实上，在我们的研究中，许多重症手足口病患者的致炎细菌显著增加。

口咽和肠道微生物群的物种数量和多样性已被证明在生命的第一年急剧增加，之后趋于稳定。在中国2岁健康儿童中，口咽部的优势菌属包括Streptococcus(RA：28.5–31.8%)、Prevotella(RA：16.1–17.3%)、Neisseria(RA：12.6–13.1%)、Veillonella(RA：8.1–9.0%)和Haemophilus(RA: 6.2–6.3%)。在本研究中，轻症和重症病例口咽微生物群组成相似。然而，与健康儿童相比，在急性期和恢复期的重症手足口病患者中发现这些属的RA存在差异。例如，机会致病菌Veillonella增加(17.1, 15.5, 9.0%)，Neisseria(5.8, 4.4, 12.6%)和Haemophilus(2.5, 1.1, 6.2%)减少。然而，这些差异并不显著。相比之下，轻度手足口病患者没有表现出这种变化。在最近的一项研究中，Ma等人比较了COVID-19患者和健康对照组之间的口咽微生物群，发现包括Veillonella属在内的条件致病菌显著富集。他们得出结论，口咽微生物群的改变和功能差异与COVID-19严重程度相关。我们的结果与上述研究的结果一致。无论疾病严重程度如何，与健康对照组相比，手足口病患者的肠道细菌组成不同。健康儿童的肠道菌群以Bacteroides、Faecalibacterium、Bifidobacterium、Prevotellium、Fusobacterium、Pseudobutyrivibrio和Lachnoclostridium为主，而轻症患儿肠道菌群以Ezakiella、Prevotella、Peptoniphilus、Finegoldia和Anaerococcus为主。重症患者的肠道菌群以Enterococcus、Prevotella、Bacteroides和Escherichia-Shigella等炎症诱导细菌为主。口咽和肠道常见属的变化的临床和免疫学相关性以及这些变化将持续多长时间仍有待阐明。

本研究的结果还表明，重症手足口病患者的口咽微生物群以几种细菌属为主，包括Stenotrophomonas、Prevotella和Streptococcus。这一结果与最近几项关于COVID-19患者口咽菌群的研究一致。在流感病毒感染的患者中也观察到这些细菌，这些患者通常患有继发性细菌性肺炎。口咽部微生物群中的SDPG已被证明与流感病毒感染患者的继发性细菌感染有关。60%以上的重症流感患者携带SDPG，以Streptococcus、Prevotella和其他相关属为主。这些属于SDPG的细菌物种随后会导致严重的肺炎和菌血症，死亡率很高。最近的另一项研究报告称，重症COVID-19患者气道中SDPG的比例明显高于轻度COVID-19患者。Streptococcus是成人和儿童口咽和呼吸道最普遍的细菌之一。最近的研究报告称，与健康对照组相比，COVID-19感染患者中Streptococcus和Velionella的比例有所降低。Prevotella微生物表现出促炎特性。既往研究表明，其在口腔微生物群或鼻咽微生物群中的相对丰度分别与COVID或COVID-19严重程度呈正相关。此外，Lai等人也报道了COVID-19患者口咽微生物群中的Prevotella_7显著富集，并与炎症生物标志物C-反应蛋白水平呈正相关。Stenotrophomonas是一种毒力因子较少的生物，包括外排药物泵、鞭毛和铁载体，可引起机会性感染。最近，Paine等人报道其与COVID-19感染显著相关。因此，这些富集的细菌属是否有助于手足口病的进展和严重程度仍有待研究。

本研究存在一些局限性。首先，参与者人数有限。将患者分为轻症和重症组后，每组的样本量变得更小。比较EV-A71和CV-A16引起的手足口病患者时，CV-A16引起手足口病的患者只有3例。两组之间的肠道菌群组成和丰富度似乎存在差异。这一结果与之前的研究结果一致。还需要对大量参与者进行进一步研究。其次，由于从儿童和儿科患者身上采集直肠拭子更方便，我们使用直肠拭子而不是粪便样本进行肠道微生物组分析。包括我们自己在内的研究表明，直肠拭子中发现的OTUs数量和细菌组成与儿童粪便中的OTUs数量和细菌组成非常相似。第三，恢复期样本主要采集于发病后7-12天。患者出院当日采集恢复期样本。虽然有些患者的微生物恢复时间不能完全代表，但重症患者恢复期的细菌组成有所恢复，一定程度上恢复到轻症患者观察到的水平。第四，这项研究没有将健康儿童作为对照。本研究旨在调查和比较轻度和重度手足口病患者的微生物群生态失调。

综上所述，本研究表明，重症手足口病患者的肠道微生物群多样性明显受损，并且经常检测到炎症诱导细菌。手足口病患者从急性期到恢复期，肠道菌群组成发生了变化。此外，重症患者口咽部携带的优势细菌似乎与肠道中观察到的细菌相似。进一步的研究需要大量的参与者来验证我们的研究结果。