精准前沿 | 通过对end-motif的去卷积分析揭示cfDNA的片段图谱

本期《精准前沿》栏目分享由香港中文大学卢煜明教授的研究团队于2023年4月发表在PNAS（IF =12.779）期刊上的一篇研究[1]，研究中采用了NMF（非负特征矩阵因子分解方法）对93个小鼠cfDNA的end-motif频谱进行特征分解，得到了6种不同类型的末端序列特征组合模式（F-profiles）；并进一步探索了三种DNA核酸酶（DNASE1, DNASE1L3, DFFB）在cfDNA分子中的贡献；最后，利用从小鼠中产生的F-profile，在人类cfDNA中进行外推，并确定在人类cfDNA样本中每种F-profile的贡献占比，该方法可能可用于免疫疾病检测和癌症检测。

研究背景

cfDNA的片段化是非随机的，其中至少有部分是由各种DNA核酸酶所介导的（脱氧核糖核酸酶1样3（DNASE1L3）、脱氧核糖核酸酶1（DNASE1）和DNA断裂因子亚基β（DFFB）），最终形成了特征性的cfDNA末端序列频谱；2020年发表的研究表明：cfDNA片段化是分阶段的，最初，cfDNA可能在细胞内被DFFB及DNASE1L3裂解，分别偏好性地形成了A-end和C-end片段；然后，在细胞外由DNASE1L3及DNASE1进行裂解，DNASE1会偏好性地形成T-end片段（Han et al., 2020）；且已有研究发现通过腺相关病毒转导DNASE1L3到DNASE1L3缺陷小鼠模型中时，不仅可以恢复DNASE1L3缺陷并且可以将异常的end-motif profile恢复到WT型小鼠正常cfDNA中存在的end-motif profile，表明end-motif可能是核酸酶活性恢复后监测治疗响应的一种生物标志物；因此，研究人员推断从整体上探索不同类型的cfDNA裂解模式具有临床意义，且能帮助探索cfDNA片段化的生物机制。

本研究中采用了NMF（非负特征矩阵因子分解方法）将256种end motif频谱作为一个整体进行特征分解，得到不同的motif组合模式，并进一步探索了三种DNA核酸酶（DNASE1, DNASE1L3, DFFB）在cfDNA分子中的贡献。

研究设计

1. 研究框架

本研究整体研究框架如下图1所示，大致可以分成四个步骤：首先，对93个小鼠的cfDNA样本进行测序，分别提取每个小鼠cfDNA片段5’末端的连续4bp碱基序列，并计算每种end motif序列的频率占比，即可得到93*256维的矩阵；然后，通过NMF算法对M矩阵进行解构，发现了六种不同类型的end-motif组合模式（即F-profiles）。通过小鼠研究发现：F-profile I、II和III分别与DNASE1L3、DNASE1和DFFB的裂解偏好有关；接着，基于从小鼠cfDNA中得到的F-profile可以外推到人类cfDNA中，以得到人类cfDNA样本中每种F-profiles的贡献占比（称为末端序列的去卷积分析）；最后，在人类cfDNA中探索可能的应用场景，包括：核酸酶活性监测，免疫性疾病检测和癌症检测。

图1. 整体研究框架  

2. 研究队列

本研究中使用的小鼠队列和人类cfDNA队列信息可见下表1和表2。  

表1. 小鼠队列信息

表2. 人类队列信息  

3. End motif 频率计算及标准化

对93个小鼠的血浆或尿液的cfDNA进行测序后，即可提取每个小鼠cfDNA片段5’末端的连续4bp碱基序列，并计算每种end motif序列的频率占比。为使人类和小鼠之间的motif分布具有可比性，基于人类和小鼠的参考基因组，对人类和小鼠的end motif频率进行标准化：

（1）在参考基因组的每条染色体上采用4bp的滑动窗口，统计每种motif的概率，得到期望频率E；

（2）然后，对实际样本的观测频率O进行标准化（O/E）；

（3）最后，除以所 有256个校正后的频率和，即得到校正后的motif频率。  

4. NMF算法计算得到F-profiles

NMF算法的定义是对于一个非负矩阵M，可以分解成两个非负矩阵的乘积：M=W*F，其中，M矩阵维数是93*256，每一行代表一个cfDNA样本，每一列代表一种motif序列；F矩阵代表F-profiles，其维数是n*256；W矩阵在文中指的是F-profiles的相对权重值，其维数是93*n；其中n是可变的，指的是我们需要得到的F-profile的数目；由于n是可变的，所以F矩阵并非唯一的；如何确定最优的n呢？文中是通过权衡错误率及结果重复性来确定的，错误率的量化是通过计算M原始矩阵与W*F矩阵乘积差的范数，即度量变换前后矩阵之间的误差；结果重复性的量化规则是采用五折交叉验证的方式，计算每一折得到的F矩阵之间余弦相似性的平均值；然后枚举n=1-10，在每种n下都可以得到一个错误率和重复性值，然后选取错误率最低（蓝色线）且重复性（红色线）最高时对应的n，因此，最终选取最优的F-profile的数目是6。

图2. 探索最优的n值

当n确定后，F和W矩阵也确定了，W矩阵也叫权重矩阵，表示每个样本中每种F-profile的贡献度（占比），行表示一个样本，列对应每种F-profile的权重值；P表 示某个样本的权重向量，该向量累加和为1；且NMF解构出来的矩阵具有可加性，对于一个样本的motif向量X，每种F-profile乘以对应的权重值进行累加后可以得到原始的X向量 ，X=∑i(Pi*Fi)。

研究结果

1. 从小鼠cfDNA中获得End motif图谱

七种不同类型小鼠的end motif图谱如图3所示，从图中可以看出，不同的类型具有不同的end-motif模式；在小鼠的血浆样品中，Dnase1l3（B）与Dffb（D）缺陷小鼠与WT（A）都存在明显的差异；在小鼠的尿液样品中，Dnase1（G）缺陷小鼠与WT（E）在T-end存在显著差异，但是，与Dnase1l3（F）缺陷小鼠从视觉上看不出差异；因此，尝试用NMF算法将256种motif作为一个整体进行分析，而不是专注于一个或几个特定的motif种类。

图3.七种不同类型小鼠模型的end motif图谱

2. 对end motif图谱进行去卷积分析

基于NMF算法去卷积分析得到6种F-profiles及在各个样本中每种F-profile的贡献度，进一步在7种不同类型的小鼠中探索F-profile与DNA核酸酶的关系：

F-profile I：图4.B中显示C-end具有明显优势（55%），尤其是CCNN序列；图4.A血浆样本中 Dnase1l3缺陷小鼠（2.7%）与WT小鼠相比F-profile I （35.4%）的贡献值显著下降，因此，F-profile I被认为与DNASE1L3活性相关；

F-profile II：图4.C表现出对T-end的明显偏好（51%），尤其是TGNN序列；图4.A血浆以及尿液样本中，Dnase1缺陷小鼠（11.6%）与WT小鼠相比F-profile II （43.4%）的贡献值显著下降，从WT小鼠中可看出F-profile II在尿液中贡献值显著高于血浆，因此，F-profile II被认为与DNASE1活性相关；

F-profile III：图4.D表现出对A-end的明显偏好（40%），图4.A血浆样本中 Dffb缺陷小鼠（0%）与WT小鼠（10%）相比F-profile III的贡献值显著下降，因此，综合认为F-profile III与DFFB活性相关。

图4. 通过NMF算法去卷积分析得到6中F-profile示意图

3. 小鼠血浆体外培养过程中end motif的去卷积分析

为进一步测试F-profiles是否可用于反映核酸酶在cfDNA片段化过程中的贡献程度：在肝素和EDTA两种条件下对小鼠血浆进行体外培养，分别测量0h及6h F-profileII 与 III贡献值的变化。

1、已有研究表明，肝素可以破坏核糖体结构，增强DNASE1的裂解；图5.A所示，WT小鼠在肝素存在条件下培养6h后，F-profile II贡献值显著增加，而在Dnase1缺陷小鼠中，F-profile II （DNASE1）水平在培养6小时后有所下降。

2、在有EDTA存在的情况下，全血培养6小时后，与0h的数据相比，WT小鼠血浆中的平均F-profile III（DFFB）水平显著增加（图5.B）。相反，Dffb-/-小鼠血浆中的F-profile III（DFFB）没有明显变化（5.6% vs. 4.5%）。

这些结果进一步证明了核酸酶与F-profiles之间存在一定的联系，且在一定程度上可用于反映核酸酶的活性。

图5. 小鼠血浆体外培养结果图

4. 人类血浆和尿液cfDNA end motif的去卷积分析

因为人类和小鼠核酸酶（DNASE1L3, DNASE1, DFFB）的氨基酸序列具有高度同源性，序列相似性分别为82%、79%和76%；且通过对小鼠和人类cfDNA中end motif频率进行标准化后，进一步提出了将从小鼠中得到的F-profile外推到人类cfDNA中的假设；

在人类cfDNA血浆和尿液结果如下图6.ABC所示，对配对的血浆和尿液的18例健康样本（dataset6）应用F-profile得到各个样本在F-profile的贡献度，发现在血浆样本中F-profile I占比高达42.9%；在尿液样本中F-profile I占比低，而F-profile II占比高达43.4%。

在dataset1队列中进行分析，与健康人及父母亲的cfDNA相比（图6.D&E），DNASE1L3基因突变患者F-profile1的贡献值显著减少；这些结果与在小鼠当中的结论是一致的；表明F-profile分析可以在鼠类和人类cfDNA样本之间进行推广。

图6. 人类血浆和尿液cfDNA中F-profiles贡献度结果图

5. 探索F-profiles的应用场景，及F-profile VI的潜在生物学意义

在dataset2队列（系统性红斑狼疮患者）中进行探索，结果如图7所示：与健康人相比，SLE患者的F-profile I（DNASE1L3）贡献值显著下降，且随着疾病进展，下降程度越发明显；应用F-profile I（DNASE1L3）的贡献值对SLE患者进行分类，分类效果很好，AUC高达97%；F-profile I（DNASE1L3）贡献值与SLE活动指数呈负相关；上述结果表明，F-profile I（DNASE1L3）贡献值将为自身免疫性疾病提供一定的信息，且能用于对疾病进展的监测。

在dataset3队列（肝细胞癌）中进行探索：图8.A&B发现与健康对照组相比，确实发现HCC患者的F-profile I水平中位数下降了6.9%，而在HBV携带者中没有观察到明显的变化；图8.C&D中在6个F-profile中，F-profile VI对检测HCC患者的鉴别力最强（AUC：0.97）；F-profile VI不具有明显的末端偏好，频率占比都比较均匀。

图7. 在SLE队列中end motifs的去卷积分析

图8. HCC队列中F-profiles的贡献程度

讨论

本研究利用小鼠模型的end-motif频谱信息，基于NMF算法解构，从整体出发识别出了不同类型的cfDNA裂解模式（F-profile），当F-profile及其权重的乘积最接近于观察到的该样本的末端特征时，可以确定cfDNA样本中每个F-profile的贡献比例（即权重）；并将从小鼠中发现的结果迁移到人类cfDNA，整合了多个人类队列，对F-profile的应用场景进行了探索。文中提到其不足之处在于，构建F-profile图谱的缺陷型小鼠样本与类型是有限的，可能导致F-profile的数量识别有限。

结语

本研究中创新性的采用了NMF算法对小鼠cfDNA的end-motif频谱进行特征分解，得到了6种不同类型的末端序列特征组合模式（F-profiles）；并探索了三种DNA核酸酶（DNASE1, DNASE1L3, DFFB）与F-profiles之间的联系，最后通过在小鼠中得到的F-profiles外推到人类的cfDNA中，并探索了在免疫疾病检测和癌症检测中的应用场景。

END

参考文献：

[1]  Zhou, Z., Ma, M.-J. L., Chan, R. W. Y., Lam, W. K. J., Peng, W., Gai, W., H u, X., Ding, S. C., Ji, L., Zhou, Q., Cheung, P. P. H., Yu, S. C. Y., Teoh, J. Y. C., Szeto, C.-C., Wong, J., Wong, V. W. S., Wong, G. L. H., Chan, S. L., Hui, E. P., … Jiang, P. （2023）. Fragmentation landscape of cell-free DNA revealed by deconvolutional analysis of end motifs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 1 20 ( 17) , e2220982120. https://doi.org/10.1073/pnas.2220982120

撰写丨吴兮

编辑、排版丨SX

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