FOXO4通过抑制炎症反应减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤

徐尚娴彭科 单希胜 孟晓文 刘华跃 陶文辉 嵇富海　

苏州大学附属第一医院麻醉科，苏州 215021

国际麻醉学与复苏杂志,2023,43(04):353-359.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220623⁃00771

基金项目

国家自然科学基金面上项目（81873925，82072130）；

江苏省自然科学基金（BK20191171）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究以H9c2细胞为研究对象，建立缺氧/复氧（H/R）损伤模型模拟缺血再灌注损伤，探讨叉头框蛋白O（FOXO）4在心肌细胞损伤中的作用及对炎症反应的影响。

1材料与方法

1.1H/R模型制备

将适量H9c2细胞种于6孔板，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，含10%胎牛血清的高糖培养基培养至细胞贴壁生长，更换成经含95%N2、5%CO2无氧气体饱和处理的无血清、无糖DMEM培养基，6孔板放置于缺氧小室中，并用上述无氧气体以1 L/min的速度置换缺氧小室内的空气，30 min后将缺氧小室密闭，放入细胞培养箱培养6 h，之后换回完全培养基正常培养6 h。

1.2FOXO4过表达质粒转染H9c2细胞

H9c2细胞均匀种于6孔板，培养至细胞密度30%~50%。在1.5 ml EP管中加入200 μl无血清培养基和3 μg FOXO4过表达质粒后混匀。另一EP管中加入200 μl无血清培养基和6 μl transfect⁃mate后混匀。室温静置5 min后将两管混匀，放置20 min。将静置后的混合物加入含2 ml/孔无血清培养基的6孔板中，混匀后在培养箱中温育5 h。5 h后更换为完全培养基继续培养48 h，收集细胞用于后续实验。

1.3RNAoligo沉默H9c2细胞FOXO4基因

按说明书分别将RNAoligo和相应阴性对照序列转染于H9c2细胞。转染完毕的细胞更换完全培养基继续培养48 h，随后收集细胞用于后续实验。

1.4实验分组

H9c2细胞均匀种植于6孔板，常规培养至细胞密度达30%~50%时，采用随机数字表法将细胞分成6组（每组3孔）：对照组（Con组）细胞置于培养箱中常规培养；缺氧/复氧组（H/R组）细胞常规培养后按步骤1.1制备H/R模型；过表达FOXO4+H/R组（OF+H/R组）、过表达FOXO4阴性对照+H/R组（OF⁃NC+H/R组）细胞分别按步骤1.2行FOXO4过表达或阴性对照序列转染后按步骤1.1制备H/R模型；沉默FOXO4+H/R组（siFOXO4+H/R组）和沉默FOXO4阴性对照+H/R组（siRNA⁃NC+H/R组）细胞分别按步骤1.3行FOXO4基因沉默或相应阴性序列转染后按步骤1.1制备H/R模型。结束后收集各组细胞用于后续分析。

1.5Cell Counting Kit‑8试剂盒检测细胞存活率

将适量H9c2细胞接种到96孔板（100 µl/孔），每组6复孔。将无细胞的培养液设置为空白组以去除背景。对各组细胞分别进行相应处理后，每孔加入10 µl Cell Counting Kit‑8试剂，培养箱孵育1 h。用酶标仪450 nm处测各组细胞光密度（D）值。细胞存活率=（实验组D值－空白组D值）/（对照组D值－空白组D值）×100%。

1.6乳酸脱氢酶（LDH）测定

取100 µl乳酸脱氢酶试剂盒中的标准液按说明书制作标准曲线。将适量H9c2细胞接种到96孔板（100 µl/孔）中，每组6孔。每组细胞分别处理后取待检测上清液（50 µl/孔），根据LDH试剂盒说明步骤进行检测，然后代入标准曲线计算样本中丙酮酸含量。每毫升细胞培养上清液每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位，根据相应公式计算培养基中LDH的含量。

1.7实时荧光定量聚合酶链反应（RT⁃qPCR）检测mRNA表达水平

各组细胞经相应处理后，用Trizol加入各组细胞中提取总RNA，并将合格的RNA样本逆转录成cDNA，反应条件为：25 ℃，5 min；50 ℃，15 min；85 ℃，5 min；反应体系为20 µl。在Lighter⁃Cycler 96中进行PCR扩增反应，反应条件为：95℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s 变性，60 ℃ 30 s 退火；共进行40个循环。读取循环阈值（Ct），采用2−ΔΔCt法计算相对定量结果。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。

TNF‑α：

上游5´⁃AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA⁃3´，下游5´⁃GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG⁃3´。

IL‑1β：

上游5´⁃CACTACAGGCTCCGAGATGAAAAC⁃3´，下游5´⁃TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC⁃3´。

IL⁃6：

上游5´⁃ACAACCACGGCCTTCCCTACTT⁃3´，下游5´⁃CACGATTTCCCAGAGAACATGTG⁃3´。

甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）：上游5´⁃TGTTCTTCATGGGTGTGAAC⁃3´；下游5´⁃ATGGCATGGACTGTGGTCAT⁃3´。

1.8Western blot法检测细胞FOXO4蛋白水平

各组H9c2细胞均匀种于6孔板，经相应处理后提取细胞蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并加入蛋白上样缓冲液和生理盐水，混匀后80 ℃煮10 min。每个样本取30 μg蛋白，用10%的分离胶电泳分离后转于PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，用相应一抗（抗FOXO4抗体、抗GAPDH抗体）4 ℃孵育过夜。次日用TBST液洗膜后分别按一抗来源加入山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG的二抗，室温摇床孵育2 h后洗膜。最后用ECL液发光获得图像，使用Image J软件对条带进行灰度分析，以FOXO4/GAPDH表示目的蛋白水平。

2结果

2.1H9c2心肌细胞H/R后FOXO4蛋白水平变化

与Con组比较，H/R组FOXO4蛋白水平下降（P<0.05，图1）。

2.2FOXO4基因过表达对H/R心肌细胞FOXO4蛋白水平的影响

与OF⁃NC+H/R组比较，OF+H/R组FOXO4蛋白水平升高（P<0.01）。见图2。

2.3FOXO4基因沉默对H/R心肌细胞FOXO4蛋白水平的影响

siFOXO4+H/R组FOXO4蛋白水平低于siRNA⁃NC+H/R组（P<0.05，图3）。

2.4FOXO4过表达对H/R心肌细胞存活率的影响

与Con组比较，H/R组、OF+H/R组、OF⁃NC+H/R组细胞存活率均下降（P<0.01或P<0.05）；与H/R组比较，OF+H/R组细胞存活率上升（P<0.05）；H/R组与OF⁃NC+H/R组差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

2.5FOXO4过表达对H/R心肌细胞LDH释放的影响

与Con组比较，H/R组、OF+H/R组、OF⁃NC+H/R组上清液中LDH含量上升（P<0.01）；与H/R组比较，OF+H/R组上清液中LDH含量下降（P<0.01）；OF‑NC+H/R组与H/R组差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

2.6FOXO4过表达对H/R心肌细胞TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的mRNA表达水平的影响

与Con组比较，H/R组、OF+H/R组、OF⁃NC+H/R组TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 mRNA表达水平均升高（P<0.05或P<0.01），其中H/R组升高最明显。与H/R组比较，OF+H/R组TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的mRNA表达水平均下降（P<0.05或P<0.01）。OF⁃NC+H/R组与H/R组差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。

2.7沉默FOXO4基因对H/R心肌细胞存活率及LDH释放的影响

与siRNA⁃NC+H/R组比较，siFOXO4+H/R组细胞存活率下降（P<0.05），上清液中LDH含量上升（P<0.01）。见图7。

2.8沉默FOXO4对H/R心肌细胞TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的mRNA表达水平的影响

与siRNA‑NC+H/R组比较，siFOXO4+H/R组TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的mRNA表达水平均升高（P<0.05，图8）。

3讨论

本研究采用缺氧小室建立H9c2细胞H/R模型模拟临床缺血再灌注损伤模型，研究FOXO4在H9c2细胞H/R过程中的作用。

本研究以缺氧6 h复氧6 h作为H/R模型，发现FOXO4蛋白表达量在H/R组细胞内较对照组明显下降。我们进一步对H9c2细胞做质粒转染，过表达FOXO4蛋白，观察过表达FOXO4的H9c2细胞能否减轻H/R带来的损伤。同时，我们还对H9c2细胞进行基因沉默，观察沉默其FOXO4基因表达后H/R损伤是否会加重。研究结果表明，过表达FOXO4的H9c2细胞能有效逆转H/R造成的细胞存活率降低；同时，过表达FOXO4处理的细胞组经过H/R后，其细胞培养液中的LDH含量比单纯的H/R组细胞培养液中的LDH含量明显降低。而沉默FOXO4基因的H9c2细胞经过H/R损伤后细胞存活率更低，细胞培养液中的LDH含量更高。TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6是H/R损伤中释放量增加的促炎因子，本研究结果显示，过表达FOXO4的H9c2细胞在H/R后TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 mRNA表达水平较H/R组细胞降低，而沉默FOXO4基因后的H9c2细胞经过H/R损伤后TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 mRNA表达水平进一步升高，提示FOXO4蛋白可以抑制H9c2细胞H/R过程中的炎症反应。本研究结果和Zhou等及Chang等的研究结果吻合。

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