无菌物品【不需要】常规采样检测//感控人应熟练掌握的技能//医院消毒卫生标准 GB 15982-2012：采样方法

附录A（规范性附录）

采样及检查方法

A.1 采样和检查原则

A．1.1  采样后应尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过4 h；若样品保存于0℃～4℃时，送检时间不得超过24 h。

A．1.2  不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查，当流行病学调查怀疑医院感染事件与灭菌物品有关时，进行相应物品的无菌检查。常规监督检查可不进行致病性微生物检测，涉及疑似医院感染暴发、医院感染暴发调查或工作中怀疑微生物污染时，应进行目标微生物的检测。

A．1.3  可使用经验证的现场快速检测仪器进行环境、物体表面等微生物污染情况和医疗器材清洁度的监督筛查；也可用于医院清洗效果检查和清洗程序的评价和验证。

A.2  空气微生物污染检查方法

A.2.1  采样时间

I类环境在洁净系统自净后与从事医疗活动前采样；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类环境在消毒或规定的通风换气后与从事医疗活动前采样。

A.2.2检测方法

A.2.2.1 I类环境可选择平板暴露法和空气采样器法，参照GB 50333《医院洁净手术部建筑技术规范》要求进行检测。空气采样器法可选择六级撞击式空气采样器或其他经验证的空气采样器。检测时将采样器置于室内中央0.8 m～l.5 m高度，按采样器使用说明书操作，每次采样时间不应超过30 min。房间大于10 m2者，每增加10 m2增设一个采样点。

A．2.2.2  Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类环境采用平板暴露法。室内面积≤30 m2，设内、中、外对角线3点，内、外点应距墙壁1m处；室内面积>30 m2，设4角及中央5点，4角的布点部位应距墙壁1m处。将普通营养琼脂平皿(直径90 mm)放置各采样点，采样高度为距地面0.8 m～l.5 m;采样时将平皿盖打开，扣放于平皿旁，暴露规定时间(Ⅱ类环境暴露15 min，Ⅲ、Ⅳ类环境暴露5 min)后盖上平皿盖及时送检。

A．2.2.3将送检平皿置36℃±1℃恒温箱培养48 h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。

A.2.3  结果计算

A．2.3.1  平板暴露法按平均每皿的菌落数报告：CFU/（皿·暴露时间）。

A．2.3.2式(1)为空气采样器法计算公式：

A．3  物体表面微生物污染检查方法

A．3.1  采样时间

潜在污染区、污染区消毒后采样。清洁区根据现场情况确定。

A．3.2  采样面积

被采表面<100 cm2，取全部表面；被采表面≥100 cm2，取100 cm2。

A．3.3  采样方法

用5 cm×5 cm灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有无菌0.03 mol／L磷酸盐缓冲液或生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1～4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有10 mL采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体采样。若采样物体表面有消毒剂残留时，采样液应含相应中和剂。

A．3.4  检测方法

把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0 mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15 mL～20 mL，36℃±1℃恒温箱培养48 h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。

A．3.5  结果计算[如式(A．2)]

A.4  医务人员手卫生检查方法

A.4.1  采样时间

采取手卫生后，在接触病人或从事医疗活动前采样。

A.4.2  采样方法

将浸有无菌0.03 mol／L磷酸盐缓冲液或生理盐水采样液的棉拭子一支在双手指曲面从指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积约30 cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10 mL采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米(cm2)计算。若采样时手上有消毒剂残留，采样液应含相应中和剂。

A.4.3  检测方法

把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0 mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15 mL～20 mL，36℃±1℃恒温箱培养48 h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。 

A．4.4  结果计算[如式(A．3)]

A．5  医疗器材检查方法

A．5.1  采样时间

在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。

A.5.2  灭菌医疗器材的检查方法

A．5.2.1  可用破坏性方法取样的，如一次性输液（血）器、注射器和注射针等按照《中华人民共和国药典》中“无菌检查法”进行。对不能用破坏性方法取样的医疗器材，应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹，采样取全部表面或不少于100 cm2；然后将除去手接触部分的棉拭子进行无菌检查。

A．5.2.2 牙科手机：应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中，将每支手机分别置于含20 mL～25 mL采样液的无菌大试管(内径25 mm)中，液面高度应大于4.0 cm，于旋涡混合器上洗涤震荡30 s以上，取洗脱液进行无菌检查。

A.5.3  消毒医疗器材的检查方法

A．5.3.1 可整件放入无菌试管的，用洗脱液浸没后震荡30 s以上，取洗脱液1.0 mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15 mL～20 mL，36℃±1℃恒温箱培养48 h，计数菌落数(CFU/件)，必要时分离致病性微生物。

A．5.3.2 可用破坏性方法取样的，在100级超净工作台称取1 g—10 g样品，放入装有10 mL采样液的试管内进行洗脱，取洗脱液1.0 mL接种平皿，计数菌落数(CFU/g)，必要时分离致病性微生物。对不能用破坏性方法取样的医疗器材，在100级超净工作台，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面<100 cm2，取全部表面，被采表面≥100 cm2，取100 cm2，然后将除去手接触部分的棉拭子进行洗脱，取洗脱液1．0 mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15 mL～20 mL，36℃±1℃恒温箱培养48 h，计数菌落数(CFU/cm2)，必要时分离致病性微生物。

A．5.3.3  消毒后内镜：取清洗消毒后内镜，采用无菌注射器抽取50 mL含相应中和剂的洗脱液，从活检口注入冲洗内镜管路，并全量收集（可使用蠕动泵）送检。将洗脱液充分混匀，取洗脱液1.0 mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15 mL～20 mL，36℃±1℃恒温箱培养48 h，计数菌落数(CFU/件)。将剩余洗脱液在无菌条件下采用滤膜(0. 45 μm)过滤浓缩，将滤膜接种于凝固的营养琼脂平板上（注意不要产生气泡），置36℃±1℃温箱培养48 h，计数菌落数。

当滤膜法不可计数时：

菌落总数（CFU/件）=m(CFU/平板)×50  …(A．4)

式中：

m-两平行平板的平均菌落数。

当滤膜法可计数时：

菌落总数（CFU/件）=m(CFU/平板)+mf（CFU/滤膜）…(A．5)

式中：

m-两平行平板的平均菌落数；

mf -滤膜上菌落数。

A.6  消毒剂检查方法

A.6.1  消毒剂采样

采样分库存消毒剂和使用中消毒液。

A．6.2  消毒剂有效成分含量检查方法

 库存消毒剂的有效成分含量应依照《消毒技术规范》或产品企业标准进行检测；使用中消毒液的有效浓度测定可用前述方法，也可使用经国家卫生行政部门批准的消毒剂浓度试纸（卡）进行监测。

A．6.3使用中消毒液染菌量检查方法

A．6.3.1  用无菌吸管按无菌操作方法吸取1.0 mL被检消毒液，加入9 mL中和剂中混匀。醇类与酚类消毒剂用普通营养肉汤中和，含氯消毒剂、含碘消毒剂和过氧化物消毒剂用含0.1%硫代硫酸钠中和剂，洗必泰、季铵盐类消毒剂用含0.3%吐温80和0.3%卵磷脂中和剂，醛类消毒剂用含0.3%甘氨酸中和剂，含有表面活性剂的各种复方消毒剂可在中和剂中加入吐温80至3%;也可使用该消毒剂消毒效果检测的中和剂鉴定试验确定的中和剂。

A．6.3.2 用无菌吸管吸取一定稀释比例的中和后混合液1.0 mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15 mL～20 mL，36℃±1℃恒温箱培养72 h，计数菌落数；必要时分离致病性微生物。   

消毒液染菌量(CFU／mL)=平均每皿菌落数×10×稀释倍数 ……(A．6)

A．7治疗用水检查方法

血液透析相关治疗用水按YY 0572进行检测。其他治疗用水按照相关标准执行。

A．8  紫外线灯检查方法

A．8.1  紫外线灯采样

采样分库存紫外线灯和使用中紫外线灯。

A．8.2库存（新启用）紫外线灯辐射照度值检查方法   

按照GB 19258进行。

A．8.3使用中紫外线灯辐射照度值检查方法

A．8.3.1 仪器法。开启紫外线灯5 min后，将测定波长为253.7 nm的紫外线辐照计探头置于被检紫外线灯下垂直距离1m的中央处，待仪表稳定后，所示数据即为该紫外线灯的辐射照度值。

A．8.3.2 指示卡法。开启紫外线灯5 min后，将指示卡置紫外灯下垂直距离1m处，有图案一面朝上，照射1 min，观察指示卡色块的颜色，将其与标准色块比较。

A．8.4注意事项

紫外线辐照计应在计量部门检定的有效期内使用；紫外线监测指示卡应取得国家卫生行政部门的许可批件，并在产品有效期内使用。

A．9  消毒器械检查方法

A．9.1  杀菌因子强度测定：按《消毒技术规范》或企业标准规定的方法进行检测。

A．9.2工作环境有害物浓度（强度）测定：按《消毒技术规范》或相关标准规定的方法进行检测。

A．10  医院污水检查方法

按GB 18466规定进行检测。

A. 11  疫点（区）消毒效果检测方法

按GB  19193规定进行检测。

A．12  大肠菌群检查方法

按照GB 4789.3进行检测。

A．13  沙门茵检查方法

按照GB 4789.4进行检测。

A. 14  乙型溶血性链球菌检查方法

按照GB/T 4789.11进行检测。

A．15  铜绿假单胞菌检查方法

按照GB 7918.4进行检测。

A．16  金黄色葡萄球菌检查方法

按照GB 7918.5进行检测。

A．17  其他目标微生物检查方法  

按照相关检测方法进行。

附  录B（规范性附录）

试剂和培养基

B．1  0.03moI/L磷酸盐缓冲液(0.03 moI/L PBS)

称取磷酸氢二钠2.84 g，磷酸二氢钾1.36 g，加入到1000 mL蒸馏水中，待完全溶解后，调pH至7. 2～7.4，于121℃压力蒸汽灭菌20 min。

B．2洗脱液

 称取蛋白胨10. 00 g，氯化钠8.50 g，吐温-80  1.0mL，加入到1 000 mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液中，加热溶解后调pH至7.2～7.4，于121℃压力蒸汽灭菌20 min。

B．3生理盐水

称取氯化钠8. 50 g，溶解于1000 mL蒸馏水中，于121℃压力蒸汽灭菌20 min。

B．4  革兰染色液及染色方法

B.4.1  结晶紫染色液：称取结晶紫1.00 g，溶解于20 mL 95%酒精中，然后与80 mL 1%草酸铵水溶液混合。

B．4.2革兰碘液：称取碘1. 00 g，碘化钾2.00 g，混合后加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL，混匀。

B．4.3沙黄复染液：称取沙黄0. 25 g，溶解于10 mL 95%酒精溶液中，然后加入90 mL蒸馏水，混匀。

B．4.4染色方法如下：

a)将涂片在火焰上固定。

b)滴加结晶紫染色液，作用1 min，水洗。

c)  滴加革兰碘液，作用1min，水洗。

d)酒精脱色30 s；或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10 s。

e)水洗，滴沙黄复染液，作用1 min，水洗。

f)  待干镜检。

B．5人（兔）血浆

取灭菌3.8%柠檬酸钠1份，加人（兔）全血4份，混匀静置，3 000 r／min离心5 min，取上清，弃血球。

B．6  普通营养琼脂培养基

B．6.1  成分：蛋白胨10 g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL。

B．6.2制作方法：除琼脂外其他成分溶解于蒸馏水中，调pH至7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装于121℃压力蒸汽灭菌20 min。

B．7血琼脂培养基

B．7.1  成分：营养琼脂100 mL、脱纤维羊血（或兔血）10 mL。

B．7.2制作方法：将营养琼脂加热熔化待冷至50℃左右，以无菌操作将10 mL脱纤维血加入后摇匀，倾注平皿，置冰箱备用。 

B．8 需-厌氧菌培养基

B．8.1成分：酪胨（胰酶水解）15 g、牛肉膏3g、葡萄糖5g、氯化钠2.5 g、L-胱氨酸0.5 g、硫乙醇酸钠0.5 g、酵母浸出粉5 g、新鲜配制的0.1%刃天青溶液1．o mL或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5 mL、琼脂0.5 g～0. 7g、蒸馏水1 000 mL。

B．8.2制作方法：除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入蒸馏水中，微温溶解后，调pH至弱碱性，煮沸、滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH至6.9～7.3，分装后115℃压力蒸汽灭菌30 min。

B．9 SCDLP液体培养基

B．9.1  成分：酪蛋白胨17 g、大豆蛋白胨3g、葡萄糖2.5 g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5 g、卵磷脂lg、吐温-80  7g、蒸馏水1 000 mL。

B．9.2制作方法：将各种成分混合（如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨可用日本多胨代替），加热溶解后，调pH至7.2～7.3，分装于121℃压力蒸汽灭菌20 min，摇匀，冷至25℃使用。

B．10伊红美蓝培养基

B．10.1成分：蛋白胨10 g、乳糖10 g、磷酸二氢钾2g、2%伊红溶液2 mL、0.65%美蓝溶液1 mL、琼脂17 g、蒸馏水1000 mL。

B．10.2制作方法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH至7.1，分装后121℃压力蒸汽灭菌20 min。临用时，以无菌操作加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50℃时，加入伊红和美蓝溶液摇匀，倾注平皿，置4℃冰箱备用。

B．11 0.5%葡萄糖肉汤培养基

B．11.1  成分：胨10 g、氯化钠5g、葡萄糖5g、肉浸液1000 mL。

B．11.2制作方法：取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调pH至弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调pH至7.0～7.4，分装，于115℃压力蒸汽灭菌30 min。

B．12甘露醇培养基

B．12.1  成分：蛋白胨10 g、牛肉膏5g、氯化钠5g、甘露醇10 g、0.2%溴麝香草酚蓝溶液12 mL、蒸馏水1 000 mL。

B．12.2 将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加入蒸馏水中，加热溶解，调pH至7.4，加入甘露醇和溴麝香草酚蓝混匀后，分装，于115℃压力蒸汽灭菌20 min。

B．13  乳糖胆盐发酵管

GB 15982-2012

B．13.1成分：蛋白胨20 g、猪胆盐（或牛，羊胆盐）5g、乳糖10 g、0.04%溴甲酚紫水溶液25 mL、蒸馏水1 000mL。

B．13.2制作方法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，调pH至7.4，加入0.04%溴甲酚紫水溶液，分装(每管10 mL)，并放入一个发酵管，于115℃压力蒸汽灭菌15 min。

B．14乳糖发酵管

B．14.1  成分：蛋白胨20 g、乳糖10 g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1 000 mL。

B．14.2制作方法：将蛋白胨及乳糖溶解于蒸馏水中，调pH至7.4，加入0.04%溴甲酚紫水溶液，分装(每管10 mL)，并放入一个发酵管，于115℃压力蒸汽灭菌15 min。

B．15溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基

B．15.1  成分：蛋白胨10 g、葡萄糖5g、2%溴甲酚紫酒精溶液0.6 mL、蒸馏水1000 mL。

B．15.2制作方法：将蛋白胨、葡萄糖溶解于蒸馏水中，调pH至7．O～7.2，加入2%溴甲酚紫酒精溶液，摇匀后，分装(每管5 mL)，并放入一个发酵管，于115℃压力蒸汽灭菌30 min，置4℃冰箱备用。

B．16绿脓菌素测定用培养基

B．16.1  胨20 g、氯化镁（无水）1.4 g、硫酸钾10 g、甘油10 mL、琼脂18 g～20 g、蒸馏水1 000 mL。

B．16.2制作方法：取胨、氯化镁、硫酸钾加入水中，微温使溶解，调节pH使灭菌后为7.2～7.4，分装于小试管，灭菌。

B．17  明胶培养基

B．17.1  胨5 g、明胶120 g、牛肉浸出粉3g、蒸馏水1 000 mL。

B．17.2取上述各成分加入水中，浸泡约20 min，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，分装于小试管，灭菌。

B．18  注意事项

B．18.1  双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分为乳糖胆盐发酵管的2倍；3倍浓缩乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分为乳糖胆盐发酵管的3倍。

B．18.2培养基用的试管口和三角烧瓶口应用棉塞或硅胶制成的塞子，再用牛皮纸包好。

B．18.3试剂与培养基配制好后应置清洁处保存，常温下不超过1个月。培养基推荐4℃冷藏保存。