头颈部鳞癌组织和匹配血液ctDNA的基因突变一致性如何?

希腊雅典Attikon大学医院开展了一项先导性研究，旨在评估原发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者配对的肿瘤组织和循环肿瘤DNA（ctDNA）样本的体细胞突变检测结果，以及ctDNA水平变化与生存期的相关性。本研究纳入了62例接受根治性手术或放化疗的I-IVB期HNSCC患者。在基线、治疗结束（EOT）和疾病进展时获取了血浆样本。从血浆（ctDNA）和肿瘤组织（tDNA）中提取肿瘤DNA。使用NGS panel检测ctDNA和tDNA中TP53、CDKN2A、HRAS和PI3KCA这4个基因致病性变异。45例患者组织和血浆样本可及。基线tDNA和ctDNA基因检测结果的一致性为53.3%。TP53突变在基线ctDNA（32.6%）和tDNA（40%）中均最常见。基线组织样本存在这4个基因突变与总生存期（OS）较短有关 [突变患者中位58.3个月 vs. 无突变患者中位89个月，p < 0.013]。类似地，ctDNA突变阳性患者OS较短 [中位53.8个月 vs 78.6个月，p < 0.037]。EOT时ctDNA清除与PFS或OS无关。本研究表明，液体活检能够实时反映HNSCC的分子特征，并可能预测生存。需要更大规模的研究来验证ctDNA用作HNSCC生物标志物的效用。

研究背景

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）包括一组起源于上呼吸消化道的异质性肿瘤。尽管根治性治疗取得了显著进展，并且在标准实践中应用了多学科方法，但HNSCC的局部和全身复发率很高。常规影像学检查，PET/CT 和组织活检是监测复发的主要方法。然而，所涉及的解剖结构的复杂性阻碍了残留疾病的鉴定和组织的获取，影响了肿瘤生物学相关分子研究。HNSCC生物学范式的改变使癌细胞分子特征重新受到关注。

循环肿瘤DNA（ctDNA）是肿瘤细胞脱落到血液中的一种细胞外DNA（游离DNA，cfDNA）。在HNSCC和其他恶性肿瘤（如乳腺癌和结直肠癌）中，血浆ctDNA检测（称为液体活检）已成为一种重要的诊断和预后工具，与疾病严重程度和不良预后相关。此外，连续ctDNA检测能够在多个时间点对分子变异进行实时纵向监测，通常反映治疗疗效，从而可能识别肿瘤细胞中驱动耐药性的特定分子机制。有几项HNSCC相关研究正在评估PIK3CA和HRAS致癌突变，抑癌基因TP53热点致病性突变，以及HPV相关分子生物标志物用作治疗升级/降级的预后或预测因子，以指导个体化治疗。

HNSCC在分子水平上存在很大的异质性。本先导性研究旨在探索在HNSCC中，1）血浆和组织样本体细胞突变结果的一致性，2）接受治疗的患者ctDNA水平的某些动态变化是否与病程相关。为此，本研究纳入了一批HNSCC患者，评估了其基线肿瘤和血浆活检样本，以及连续血浆样本中HNSCC高频突变基因（包括TP53，CDKN2A，HRAS和PIK3CA）的突变状况。

研究结果

患者特征

在62例患者中，16例（25.8%）为女性，其余为男性（46例，74.2%）。中位年龄为64.95岁（范围为22.04至95.1岁）。基线特征如表1所示。在20例口咽癌患者中，18例p16状态可及，13例为阳性。此外，16例患者HPV DNA状态可及，10例为阳性。主要的HPV类型为16型，只有1例患者感染了35型。

表1. 患者基线特征

治疗和疗效

在62例患者中，11例（17.7%）接受了原发肿瘤切除术（5例扁桃体癌，4例口腔癌，2例喉癌）。所有这11例患者均接受了辅助放疗。在其余51例患者中，50例接受了根治性含铂化疗同步放疗，1例仅接受了放疗。21例患者接受了诱导化疗。

60例患者治疗结束时疗效评估可及。大多数患者（48例；80%）达到完全缓解（CR），4例（6.6%）部分缓解（PR），3例（5%）疾病稳定（SD），6例（10%）疾病进展（PD）。在缓解者中，中位随访25个月时，13例PD，37例维持CR，2例失访。

ctDNA和tDNA基因检测结果

45例患者基线组织样本提取肿瘤DNA（tDNA），46例患者基线血浆样本提取ctDNA，进行基因检测。基线ctDNA与tDNA基因检测结果的一致性为53.3%（24/45例患者）。30例患者治疗结束（EOT）时血浆样本可及。在27例患者中（3例患者基线组织质控不合格），只有1例患者EOT时ctDNA基因检测结果与基线tDNA一致，而与基线ctDNA的一致性为56.6%（17/30例患者）。获取了11例患者PD时的血浆样本，5/8例患者与基线tDNA结果一致（3例患者基线组织不可及），5/9例患者与基线ctDNA一致（2例患者基线血浆不可及）。此外，4/9例PD患者检出新的ctDNA变异。

在基线组织可及的45例患者中，28例患者检出突变，16例患者未检出突变。TP53致病性/可能致病性变异在ctDNA（15/46例患者，32.6%）和tDNA（18/45例患者，40%）中均最常见。CDKN2A致病性/可能致病性变异在tDNA中的检出率（8/45例患者，17.7%）高于ctDNA（2/46例患者，4.3%）。PIK3CA和HRAS致病性/可能致病性变异检出率均相对较低（2例tDNA检出，2例ctDNA检出），有趣的是，2例患者ctDNA检出HRAS变异，但tDNA未出。在4例PD患者中，血浆ctDNA检出TP53和HRAS变异，而原发肿瘤未检出这些变异。更具体地说，1例患者检出HRAS突变（HRAS_p.S145L）。tipifarnib，一种高度选择性法尼基转移酶抑制剂，可靶向该突变，但当时该药物不可及。其余3例患者检出TP53突变（TP53_p Y220C，TP53_p.C176Y和TP53_p.H214R）。

在20例口咽癌患者中，13例p16阳性，其中10例基线tDNA和ctDNA可及。3例患者组织检出突变（2例检出PI3KCA突变，1例检出TP53突变），5例患者血浆检出突变（3例检出TP53突变，1例检出PI3KCA突变，1例检出HRAS突变）。

41%（19/46）的基线ctDNA样本检出突变（ctDNA阳性）。其中，2例患者EOT时样本不可及。在其余17例基线ctDNA阳性样本中，有8例在EOT时ctDNA清除（未检测到突变）。我们随后评估了EOT时ctDNA未清除样本的变异水平动力学。计算EOT/基线时中位变异丰度（VAF）之比。在EOT时ctDNA未清除的9例患者中，6例患者ctDNA至少一个变异VAF增加，1例患者VAF降低，2例患者检出新突变。

此外，在12例EOT时ctDNA阳性患者中，有5例出现疾病进展，其中3例局部复发，2例远处转移。

与生存期的相关性

中位随访25个月时，28例患者死于疾病。中位总生存期（OS）为49.9个月（95% CI：58.50–78.84）。中位无进展生存期（PFS）为43.45个月（95% CI：59.7–82.3）。

P16阳性状态与PFS（p < 0.014）和OS（p < 0.014）较长相关。此外，口腔癌与PFS [中位51.3个月（95% CI 30.60–72.10） vs. 口咽癌74.8个月（95% CI 60.12–89.57） vs. 喉癌87.5个月（95% CI 71.97–103.14），p < 0.012] 和OS [中位44.2个月（95% CI 26.81–61.74） vs. 口咽癌74.1个月（95% CI 59.06–89.21） vs. 喉癌86.4个月（95% CI 69.91–103.01）， p < 0.001] 较短相关。基线时总体突变状态（组织或血浆样本检出突变）与PFS [中位PFS：突变患者66.1个月（95% CI 50.66–81.58） vs. 无突变患者76.72个月（95% CI 58.1–95.35），p < 0.382] 和OS [中位OS：突变阳性患者62.5个月（95% CI 48.25–76.77） vs. 突变阴性患者80.6个月（95% CI 65.28–95.99），p < 0.135] 无关。重要的是，组织样本突变阳性与较短的PFS [中位60.3个月（95% CI 43.54–77.21） vs. 86个月（95% CI 72.43–99.61），p < 0.045] 和OS [中位58.3个月（95% CI 42.83–73.79） vs. 89个月（95% CI 78.89–99.14），p < 0.013] 显著相关（图1a和1b）。

图1 1a 组织突变状态与PFS较短相关（p＜0.045）；1b 组织突变状态与OS较短相关（p＜0.013）

基线血浆样本存在突变也与OS较短相关 [中位53.8个月（95% CI 36.37–71.38） vs. 78.6个月（95% CI 65.28–92.06），p < 0.037]，但与PFS无关 [中位61.3个月（95% CI 41.46–81.16） vs. 75个月（95% CI 59.98–90.21），p < 0.383]（图2）。

图2 基线血浆突变状态与OS显著相关（p＜0.037，2b），但与PFS无关（p＜0.383，2a）

EOT或PD时ctDNA阳性与生存期无关。此外，EOT时ctDNA清除与PFS [中位55.2个月（95% CI 25.29–85.08） vs. 39.06个月（95% CI 12.70–65.42），p<0.71] 和OS [中位41.5个月（95% CI 19.05–63.98） vs. 52.3个月（95% CI 30.26–74.39），p <0.808] 无关，可能是由于样本量较小。类似地，EOT时VAF增加或检出新突变与生存期无关（52.5个月 vs. 54.1个月，p <0.61）。

在30例EOT样本可及的患者中，18例患者ctDNA阴性（基线时也阴性或EOT时清除）。14/18例患者影像学也显示CR或PR。将EOT时ctDNA阴性且EOT时CR或PR患者的生存结局，与EOT时ctDNA阴性且EOT时SD/PD，或EOT时ctDNA阳性（无论影像学结果如何）患者的生存结局进行了比较。这些亚组的OS没有显著差异 [中位OS：EOT时PR患者67.4个月（95% CI 47.63–87.28） vs. EOT时SD/PD或ctDNA阳性患者49.6个月（95% CI 29.50–69.66），p < 0.316]。此外，ctDNA清除与复发没有显著相关性（x2，p = 0.620）。多变量Cox比例风险模型未显示任何影响PFS或OS的独立预后因素。

鉴于p16阳性（p16 +）口咽癌患者的生存期优于p16阴性口咽癌患者，我们重新分析了不包括p16 +患者（13/62例）的数据。在剩余的49例患者中，48例患者EOT时疗效评估可及。正如预期的那样，EOT时疾病进展与生存期较短相关 [PD患者中位23.9个月（95% CI 11.9–35.85） vs. CR/PR患者中位80.9个月（95% CI 67.80–94.08），p < 0.001]。此外，与口腔癌/口咽癌相比，喉癌与OS和PFS较长显著相关（中位OS：喉癌89.2个月 vs. p16- 口咽癌49.5个月 vs. 口腔癌44.2个月，p = 0.002；中位PFS：喉癌86.4个月 vs. p16- 口咽癌47.5个月 vs. 口腔癌47.6个月，p = 0.015）。

关于ctDNA阳性状态，基线时或基线和EOT时血浆检出突变与OS较短相关 [中位43.1个月（95% CI 23.12–61.09） vs. 73.6个月（95% CI 58.2–89.17），p = 0.023]（图3）。更具体而言，基线时突变阳性与OS较短显著相关（中位42.1个月 vs. 73.6个月，p <0.023）。相比之下，EOT时突变阳性与OS无关（中位OS：54个月 vs 22.2个月，p < 0.771）。组织突变状态与OS无关（p < 0.135）（图4）。EOT时>1个突变VAF增加或检出新突变与OS无关。在HNSCC病程和治疗过程中纵向跟踪ctDNA动力学的患者结果如图5所示。

图3 p16阴性疾病患者血浆突变阳性状态与OS相关

图4 p16阴性患者组织突变状态与OS无关（p＜0.136）

图5 ctDNA动力学

讨 论 

肿瘤发生发展的分子背景提供重要的预后和预测信息。分子检测的广泛应用使得人们对HNSCC等肿瘤的分子机制有了更深入的了解。2015年，癌症基因组图谱（TCGA）发表了有关HNSCC基因检测结果的数据，描述了烟草和HPV相关疾病的主要分子变异。在本研究中，我们使用基于NGS的技术（SafeSeq）对组织和血浆样本进行深度测序，识别TP53、CDKN2A、HRAS和PIK3CA这4个基因突变，TCGA显示HNSCC患者中这4个基因突变发生率较高。从接受根治性治疗的非转移性HNSCC患者获取了组织和连续血浆样本，检测这些基因突变。

与TCGA一致，本研究队列中大多数烟草驱动肿瘤都携带TP53基因突变。CDKN2A突变频率相对低很多，PI3KCA和HRAS基因突变较少见。

重要的是，我们发现，基线时组织和血浆样本SafeSeq panel检出这4基因突变与OS较短相关。既往研究显示，在HNSCC中，组织肿瘤DNA存在TP53突变与生存期较短、临床行为具有侵袭性和治疗耐药有关。与本研究结果类似，Fernandez-Mateos等人分析了来自局部晚期HNSCC患者的234份治疗前FFPE肿瘤组织样本，也发现tDNA突变阳性与OS较短相关。与此相比，Vossen等人评估了77例局部晚期HNSCC患者的治疗前肿瘤活检冷冻样本，发现突变阳性与OS无关，CCND1和CDKN2A共突变除外。有趣的是，当排除p16阳性疾病患者时，单组织样本突变阳性与OS的相关性失去统计学意义。鉴于这一结果，我们假设，整个队列组织突变状态与OS的相关性可能是由于队列中HPV +患者缺乏突变或样本量较小。

与本研究一致，一项研究显示，血浆ctDNA突变阳性与较短的OS相关。Wilson等人回顾性分析了75例I-IVC期HNSCC患者的tDNA和ctDNA基因检测结果，发现血浆样本ctDNA突变阳性与OS较短显著相关。其他几项研究未报告血浆突变阳性与OS存在相关性。

本研究队列中，45例患者基线时组织和血浆可及，组织和血浆的一致性约为53%。在Wilson等人之前的一项研究中，一致性低很多（13%）。Porter等人评估了60份HNSCC、甲状腺癌和唾液腺癌患者血液样本的NGS结果，其中30例患者有组织样本用于比较。在该研究中，组织和血浆基因检测结果的一致性为66%。其他几项研究显示，组织和血浆样本的突变检测结果一致性较低。Perdomo等人的研究纳入了36例HNSCC患者，比较肿瘤组织、血浆和口腔冲洗液的基因检测结果，发现各样本TP53突变的一致性较低，血浆与组织的一致性为2.7%，口腔冲洗液与组织的一致性为11%。类似地，Galot等人分析了局部晚期或转移性HNSCC患者的18份组织和血液样本的NGS结果，一致性为20%。血浆和组织样本之间的这种一致性差异可能是由于各研究中突变检测方法灵敏度的差异。表2列出了上述研究的方法和结果的差异。

表2 评估HNSCC组织或血浆突变检测的研究之间的比较

在本研究中，组织和血浆样本突变不一致的某些特征值得进一步研究。值得注意的是，本研究揭示了新的仅在纵向血浆ctDNA监测患者中观察到的突变表达特征。具体来说，我们观察到2例患者肿瘤组织未检出HRAS突变，仅EOT时血浆检出HRAS变异（Q61H和Q61K）。这些患者接受了放化疗作为初始治疗，处于无病生存状态。虽然HRAS状态没有影响结局，但可能提示，液体活检或可确定治疗诱导的ctDNA中特定生物标志物的变化，是否是靶向治疗靶向的相关致癌驱动因素。与这一观点一致，本研究中，3例患者基线组织未检出HRAS突变，后来出现PD，包括1例患者在基线时检出HRAS G13V突变，在PD时EOT时再次检出该突变，以及2例患者在EOT和PD时检出HRAS S145L突变。总体而言，这些发现表明，血浆首次或持续检出HRAS突变均需要进一步监测，以进一步了解治疗期间肿瘤异质性特征。未来分析纵向HRAS突变动力学的研究可进一步探索潜在新疗法，并评估耐药机制。需要开展试验比较纵向血浆样本突变检测结果，获取更多突变信息，指导新疗法的应用。

在乳腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌等癌种中，治疗期间获取连续血浆样本，追踪ctDNA特定突变的水平，正成为有价值的早期疾病监测手段。此外，有研究报道了在HPV驱动的口咽癌中，局部晚期患者治疗完成后血浆循环肿瘤HPV16DNA转为阴性，且ctHPV16DNA的快速清除可预测有利的临床结局。在鼻咽癌中，血浆EBV DNA检出提示早期复发。本研究未发现EOT时ctDNA清除或VAF增加与OS的相关性，可能是由于样本量较小。本研究的局限性包括样本量小、回顾性、缺乏长期随访和单中心。此外，由于tDNA和ctDNA使用的阈值不同，平台一致性的评估可能不准确。与其他癌症相比，HNSCC的ctDNA和tDNA的一致性较低，可能与肿瘤异质性较大以及由于复杂的解剖位置而难以获得足够的肿瘤组织有关。因此，组织可能只代表整个肿瘤的很小一部分，更系统的疾病监测方法可能需要通过ctDNA检测。

总之，本前瞻性研究纳入了62例接受根治性治疗的非转移性HNSCC患者，获取了诊断时的肿瘤活检样本和不同时间点的连续血浆样本， 使用基于NGS的高灵敏度方法进行检测，发现组织肿瘤DNA和ctDNA可检出致病性变异。基线ctDNA与tDNA基因检测结果的一致性为53.3%。此外，基线时组织或血浆样本存在突变与OS较短有关，而EOT时ctDNA清除与PFS和OS无关，可能是由于样本量较小。本研究证明了液体活检能够实时反映肿瘤特征，并可能预测临床结果。需要大规模的前瞻性研究来评估EOT时ctDNA的预后效用。此外，需要证明ctDNA作为提示治疗后风险的“危险信号”生物标志物的效用，以便采取干预措施（如免疫治疗），改善患者生存。

参考文献：

Economopoulou P, Spathis A, Kotsantis I, Maratou E, Anastasiou M, Moutafi MK, Kirkasiadou M, Pantazopoulos A, Giannakakou M, Edelstein DL, Sloane H, Fredebohm J, Jones FS, Kyriazoglou A, Gavrielatou N, Foukas P, Panayiotides I, Psyrri A. Next-generation sequencing (NGS) profiling of matched tumor and circulating tumor DNA (ctDNA) in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Oral Oncol. 2023 Apr;139:106358. doi: 10.1016/j.oraloncology.2023.106358. Epub 2023 Mar 3. PMID: 36871349.

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