共价PROTAC：当共价化学遇上靶向蛋白降解

共价抑制剂和PROTAC是极具开发潜力的两种小分子药物形式，已被广泛和深入研究。   近年来，出现了将二者融合在一起的新技术——共价PROTAC，包括可逆共价与不可逆共价PROTAC，其中，可逆共价PROTAC既可增强与靶蛋白的亲和力，还可在靶蛋白降解后释放出来继续参与下一轮的催化降解，也许是下一代蛋白降解疗法发展的方向所在。

01、可逆非共价、不可逆共价和可逆共价

图1，小分子/蛋白结合平衡

可逆非共价结合是指以氢键、疏水力、卤键等非共价结合的方式产生的结合 ，在上述化学反应平衡式中k2=0，k-2=1，比如初代EGFR抑制剂吉非替尼、埃克替尼等；不可逆共价结合则是直接以共价键的方式与靶蛋白结合，且反应不可逆，在上述平衡式中k2=1，k-2=0，比如三代的EGFR抑制剂奥希替尼、初代BTK抑制剂伊布替尼等；而可逆共价结合则介于前述二者之间，0＜k2，k-2＜1， 生成了共价键 ，但该生成反应同时可逆，共价键能够自发断裂，将小分子解离出来，继续参与下一轮反应。 最早的可逆共价抑制剂由UCSF的Jack Taunton 课题组报道，他们基于实验中观察到正丁硫醇和2-氰基丙烯酸酯间的可逆迈克尔加成，开发出了2-氰基丙烯酰胺可逆共价弹头，可识别RSK2激酶的Cys残基。目前已经报道的其他可逆共价弹头还包括2-氰基丙烯酸酯、醛、α-羰基酰胺、硼酸等， 靶向Cys或Lys残基 。

图2，可逆共价弹头类型

相比可逆非共价与不可逆共价，可逆共价结合具有一定优势：

①共价结合的可逆性可以降低永久结合脱靶蛋白相关的潜在毒性。

②可逆共价结合可以增强与靶蛋白的结合亲和力。

③可逆共价结合的分子可以在靶蛋白降解后继续释放出来进入下一轮的抑制或催化降解。

02、共价化学×PROTAC

蛋白降解靶向嵌合体 （Proteolysis Targeting Chimeras, PROTAC） 包含三个部分：

结合POI的弹头、E3连接酶配体以及桥接二者的linker。PROTAC能够招募E3连接酶与POI，形成三元复合物使POI泛素化之后被蛋白酶体识别并降解，目前已有包括激酶、核受体、表观遗相关靶点在内的超过100种靶蛋白被成功降解。与传统的小分子抑制剂相比，其极大地扩展了可成药蛋白靶点的范围，并且在降解靶蛋白后可消除其所有功能直到蛋白重新合成。此外，PROTAC以降解靶蛋白的方式发挥作用可最大限度减少潜在的耐药性，并且可以循环利用，在催化剂量下起效，提了高药物的安全性，是目前制药界研究最为火热的新modality之一， 截至2022年12月23日，已有20个PROTAC分子推进到临床试验，进度最快的ARV-471已开展临床III期试验。

图3，PROTAC最新研究进展

目前报导的PROTAC分子与传统小分子抑制剂一样，也可分为可逆非共价、不可逆共价和可逆共价PROTAC， 其中可逆非共价的PROTAC是研究较为集中的一类 ，这主要是因为不可逆共价的PROTAC在靶蛋白降解后无法再生，失去了PAOTAC的催化功能，因而降解效果不如可逆非共价的PROTAC。根据GSK的Christopher P Tinworth等人的研究，基于依布替尼的不可逆共价PROTAC成功结合了BTK蛋白但未能降解THP-1细胞中的BTK，美国贝勒医学院的Dong Lu等人得出了类似的结论，他们开发的BTK不可逆共价PROTAC的降解效率也是远低于可逆非共价的PROTAC。

因此，科学家们也开始探索可逆共价PROTAC的应用潜力，2015年初，耶鲁大学的Craig M Crews等人报道了第一个可逆共价PROTAC，靶向ERRα （下图PROTAC_ERRα） ，采用硫氮五元杂环作为可逆共价弹头；2019年，哈佛医学院的Yang PL等人开发了基于telaprevir的可逆共价丙肝病毒NS3/4A蛋白酶PROTAC （下图的DGY-08-097分子） ，被证实可降解HCV NS3蛋白酶并抑制细胞模型中的HCV感染。此外，可逆共价PROTAC还成功降解了BTK、KRAS等蛋白。根据贝勒医学院的Dong Lu等人的平行研究， 在基于可逆非共价、可逆共价和不可逆共价弹头的BTK PROTAC 中，基于α-氰基丙烯酰胺的可逆共价PROTAC实现了最高的降解活性和最小的细胞毒性，证实了可逆共价PROTAC的优势。

图4，部分可逆/不可逆共价PROTAC结构

事实上，除了POI的ligand可以是共价结合的，PROTAC分子另一端的E3连接酶配体同样可以是共价结合的。与非共价的PROTAC相比，基于E3连接酶共价配体的PROTAC将允许PROTAC分子靶向难以与非共价配体结合的POI，扩大PROTAC应用范围。此外，随着E3-PROTAC共价复合物的形成，POI被泛素化和蛋白酶体降解后， E3-PROTAC共价复合物可以直接参与下一轮POI结合，将原来需要形成三元复合物的过程形成简化为形成二元复合物，提高降解效率。 目前已经报道共价配体PROTAC的E3连接酶包括RNF4、RNF114、KEAP1、DCAF16、FEM1B等 ，并实现了细胞水平上对BRD4、ERRα、BCR-ABL、FKBP12、CDK9、ALK等POI的成功降解，降解效率最高达94%，但总的来说效力仍不及使用非共价CRBN/VHL配体的PROTAC。 目前已知有超过600种E3连接酶在人体细胞中发挥作用，但已开发出靶向配体的E3连接酶数量仍然有限 ，主要局限在 CRBN、MDM2以及VHL 上，如果能够筛选出更多的不同种类E3连接酶配体，将能大大拓展可降解POI的范围，共价E3连接酶配体便是十分具有潜力的方向之一。该类共价配体主要通过基于 ABPP （Activity-Based Protein Profiling） 的方法进行筛选，之后再于配体基础上设计相应共价PROTAC分子，目前研究仍处于早期阶段，未来还需付出更多努力来优化这类PROTAC分子的选择性和降解能力，以将其推进到临床试验中去。

图5，部分基于共价E3连接酶配体的PROTAC结构

总结

共价PROTAC作为PROTAC技术的一支，研究仍处于起步阶段，但可逆共价PROTAC技术已引起了学术界、产业界的广泛兴趣，其融合了共价抑制剂和PROTAC的双重理论优势，既能高亲和性的结合POI，也能高效催化POI的降解，并已在临床前的平行实验中表现出较可逆非共价PROTAC及不可逆共价PROTAC更好的降解效果和安全性   ，不过其体内活性优势仍有待进一步证明。此外，我们也需要建立一个更精准有效的assay/技术平台来分析表征共价RPTOAC的结合及降解过程，以了解共价PROTAC的机制细节，帮助我们开发和优化出临床候选化合物。

Ref

[1] Kiely-Collins H, Winter GE, Bernardes GJL. The role of reversible and irreversible covalent chemistry in targeted protein degradation. Cell Chem Biol. 2021 Jul 15;28(7):952-968. doi: 10.1016/j.chembiol.2021.03.005. Epub 2021 Mar 30. PMID: 33789091.

[2] Lu D, Yu X, Lin H, Cheng R, Monroy EY, Qi X, Wang MC, Wang J. Applications of covalent chemistry in targeted protein degradation. Chem Soc Rev. 2022 Nov 14;51(22):9243-9261.

[3] 药渡

作者：LYQ

编辑人：Transparent

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来源：医药速览 2023-01-09

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