寡核苷酸合成的底层技术 – 亚磷酰胺三酯合成法！

寡核苷酸合成的底层技术亚磷酰胺三酯合成法

寡核苷酸合成是许多分子生物学应用的基础，包括聚合酶链反应（PCR）、基因编辑、DNA测序和治疗/药物输送。在过去35年里，我们在诊断检测、生物技术和药理学方面所看到的科学进步，部分是由寡核苷酸合成方面的进展所支持的。

现今大多数商业化DNA合成仪所使用的底层技术是亚磷酰胺三酯合成法（如图一），一般称为柱式合成。此方法具有高效、快速偶联等优点，在DNA化学合成中广泛使用。

DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸，而是由3’端开始。先将酸活化的脱氧核苷亚磷酰胺分子耦合到一个固定在固相（一般是硅材质表面）的脱氧核苷酸分子上。在第一个合成循环中，核苷酸链从第一个固定在表面上受保护的核苷酸分子开始延伸。其中，经常采用的固定化表面主要是可控孔度玻璃（ CPG）或者聚苯乙烯微珠（PS beads）。试剂被泵入并流经材质表面，诱导分步添加的核苷酸单体加入到寡核苷酸链上，使寡核苷酸链不断延长。

图1. 磷酰胺三酯法合成循环示意图

具体反应步骤如下：

Steps：

脱保护基团 （Deblocking）

用三氯乙酸(TCA)脱去连接在固相载体CPG上的核苷酸保护基团DMT(二甲氧基三苯基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。

活化（Activation）

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，此中间体将于CPG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

偶联（Coupling）

亚磷酰胺四唑活性中间体与CPG上核苷酸的游离5’-羟基发生亲和反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链延长一个碱基。

加帽（Capping）

缩合反应后为了防止CPG上未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常用乙酰化试剂（如乙酸酐和N-甲基咪唑混合物）来封闭此端羟基。

氧化（Oxidation）

缩合反应式核苷酸单体是通过亚磷酯键与CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

那么，如果实现这一连串的步骤呢？

DNA 合成仪就是将上述一系列化学合成过程进行自动化，精准可控的设备。仪器主要由试剂驱动系统、试剂瓶组、碱基瓶组、压力管路及输送管路、亚磷酰胺瓶、压力排气管、输送电磁阀、辅助真空、合成柱、路节流阀、废液瓶、排气装置、电导池、电池、控制器等多个部分组成。LGC Biosearch Technologies™的核酸化学产品线 (NAC – Nucleic Acid Chemistry) 旗下 MerMade™ 核酸合成仪系列，可以满足不同合成规模，通量和种类的需求，其中MerMade 6/12 合成仪是广受认可的型号，为合成必备。

MerMade™ 12合成仪

MerMade™ 6/12 寡核苷酸合成仪，专为使用标准或改良的化学方法以合成柱的形式合成 DNA，RNA 和 LNA 寡核苷酸而设计，非常适合需要中等通量且最大灵活性的实验室。该仪器已在许多大学、以及 cGMP 环境下运行的制药和诊断公司中使用。该机器有 6 个或 12 个合成柱位配置，可提供多达 24 个酰胺位置。它能够在同一轮中将标准寡核苷酸，简并寡核苷酸和修饰寡核苷酸组合在一起生产，规模从 50nmol 到 200µmol（在某些CPG载体下可超过 400µmol）不等。

注射头

合成柱位细节

让我们来仔细看看，它的标配特性和可选特性：

标配特性：

10至24个亚磷酰胺单体端口；

每列的规模范围从20nmol到超过200µmol；

软件灵活易用，可在Windows 7上运行;

提供运行记录；

混合主链能力（硫代磷酸酯和磷酸二酯）；

Dell PC 和显示器附带延长保修；

预装了标准合成方案；

包含切割装置。

10至24个亚磷酰胺单体端口；

可选特性：

低死体积瓶架，用于昂贵的改良剂；

6至12个合成柱；

多达24个亚磷酰胺单体端口（如需更多端口，可向我们询问）；

三苯甲基监测；

UPS备份以在断电时允许合成恢复；

多个试剂盖适配器；

条码读取器；

自定义软件与内部LIMS的集成。

此外，我们还提供4柱、48柱、192柱合成仪，以及一站式核酸合成试剂耗材，满足不同合成规模，通量和种类需求，详细见下表：

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