dMMR/MSI-H转移性结直肠癌TMB检测意义

免疫检查点抑制剂（ICI）是错配修复缺陷（dMMR）/微卫星高度不稳定（MSI-H）转移性结直肠癌（mCRC）患者的标准治疗方案。肿瘤突变负荷（TMB）是有希望的疗效预测标志物。本研究纳入了意大利3家医院110例接受PD-(L)1抑制剂±CTLA-4抑制剂治疗的dMMR/MSI-H mCRC患者。使用Foundation One NGS panel评估了TMB，分析了在总体人群以及不同ICI治疗方案人群中，TMB与临床结局的相关性。80例患者接受了PD-(L)1抑制剂单药治疗，30例接受了PD-(L)1抑制剂＋CTLA-4抑制剂联合治疗。中位TMB为49 mut/Mb（范围：8–251 mut/Mb）。TMB阈值为23 mut/Mb时，PFS分层最优。TMB ≤ 23 mut/Mb的患者PFS（调整后风险比[aHR] = 4.26，95% CI：1.85–9.82，p = 0.001）和OS（aHR = 5.14，95% CI：1.76–14.98，p = 0.003）显著较差。探索TMB能否有效区分不同ICI治疗方案的获益程度。在TMB > 40 mut/Mb的患者中，PD-(L)1抑制剂＋CTLA-4抑制剂联合治疗患者的PFS/OS显著优于PD-(L)1抑制剂单药治疗患者（2年PFS：100.0% vs 70.7%，p = 0.002; 2年OS：100.0% vs 76.0%，p = 0.025），而在TMB ≤ 40 mut/Mb的患者中则不然（2年PFS：59.7% vs 68.6%，p = 0.888; 2年OS：80.0% vs 81.0%，p = 0.949）。TMB较低的dMMR/MSI-H mCRC接受ICI治疗，表现出早期疾病进展，而TMB较高的患者可能从抗CTLA-4/PD-1联合治疗中获益较多。

研究背景

所有主要指南均推荐免疫检查点抑制剂（ICI）用于错配修复缺陷（dMMR）/微卫星高度不稳定（MSI-H）（∼5%）的转移性结直肠癌（mCRC）。关键性试验报道，PD-1单药治疗的长期无进展生存率（PFS）高达30%-50%，抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）+抗PD-1联合治疗高达50%-70%。然而，尽管这部分患者实现了持久缓解和长期疾病控制，但多达30%的ICI治疗患者仍然出现与治疗耐药性相关的早期疾病进展。使用预测因子来选择能获益于特定ICI方案的MSI-H mCRC有助于改善患者生存。

在新兴生物标志物中，肿瘤突变负荷（TMB），即肿瘤基因组每个编码区域的突变总数，在多种肿瘤类型中，与ICI治疗的临床结局相关。与大多数微卫星稳定（MSS）mCRC不同，MSI-H / dMMR肿瘤TMB较高，移码突变负荷较高。ICI在dMMR/MSI-H人群中的临床疗效是通过在存在大量高免疫原性肿瘤新抗原的情况下恢复T细胞反应来介导的。尽管如此，一项概念验证小型队列研究表明，在dMMR/MSI-H mCRC患者中，TMB具有高度异质性，特定TMB值可能与ICI治疗结局差异相关。本研究纳入了大量接受PD-(L)1抑制剂单药治疗或PD-(L)1抑制剂+CTLA-4抑制剂联合治疗的dMMR/MSI-H mCRC患者，探索了TMB在这类人群中可否作为有效的生物标志物。

研究结果

患者特征

纳入了意大利3家医院2016年1月至2022年2月期间接受ICI治疗的110例dMMR/MSI-H mCRC患者。表1展示了患者基线特征。30例患者（27.3%）接受了PD-(L)1抑制剂+CTLA-4抑制剂联合治疗，其余患者接受了PD-(L)1抑制剂单药治疗。46例（41.8%）患者接受了免疫治疗作为一线治疗。中位TMB为49 mut/Mb [四分位距（IQR）：35–69 mut/Mb; 范围：8–251 mut/Mb]。98例（89.1%）患者使用原发灶样本进行了全面基因组测序（CGP），12例（10.9%）使用了转移灶样本。根据主要临床、病理和治疗特征 [包括林奇综合征状态和特定错配修复（MMR）蛋白表达缺失] 对患者进行分类，中位TMB值无显著差异。

表1. 患者特征

TMB的预后作用

总体人群的中位随访时间为26.8个月（IQR：24.3-36.6个月）。图1展示了PD-(L)1抑制剂单药治疗vs PD-(L)1抑制剂+CTLA-4抑制剂联合治疗的PFS和OS曲线。

图1. PD-(L)1抑制剂单药治疗vs PD-(L)1抑制剂+CTLA-4抑制剂联合治疗的（A）PFS和（B）OS Kaplan Meier曲线

TMB阈值为23 mut/Mb时，PFS分层最优。根据该阈值，11例（10%）患者TMB较低（≤ 23 mut/Mb），99例（90%）患者TMB较高（> 23 mut/Mb）。低TMB患者的PFS和OS明显比高TMB患者差（mPFS 13.4个月vs未达到 [NR]; 风险比 [HR] = 4.72，95% CI=2.1–10.9，p < 0.001; 中位总生存期（mOS）25.0 vs NR; HR = 3.36，95% CI = 1.22–9.21，p = 0.019; 图2）。

图2. 不同TMB（阈值23 mut/Mb）患者的（A）PFS和（B）OS Kaplan Meier曲线

进行单因素和多因素分析，以评估不同基线临床病理因素对PFS和OS的影响。在多因素分析中，只有TMB和ECOG PS与PFS和OS均显著相关。有趣的是，与散发性肿瘤患者相比，已知林奇综合征的患者与较长的PFS（p = 0.119）和OS（p = 0.172）（不显著）相关，而特定MMR蛋白表达缺失（MLH1/PMS2 vs MHS2/MSH6 vs 其他）与预后无关。

TMB与特定免疫治疗方案疗效的相关性

探索了TMB能否有效区分不同ICI治疗方案的获益程度。基于PFS预测的最佳阈值为40 mut/Mb。在TMB > 40 mut/Mb的患者中，CTLA-4抑制剂联合治疗患者的PFS显著优于PD-(L)1抑制剂单药治疗患者（2年PFS：100.0% vs 70.7%; log-rank p = 0.002，HR无法评估），而在TMB ≤ 40 mut/Mb的患者中，则不是如此（2年PFS：59.7% vs 68.6%; HR = 0.54，95% CI：0.16–1.81，log-rank检验p = 0.888）（图 3A）。类似地，在TMB > 40 mut/Mb的患者中，联合治疗与OS较优相关（2年OS：100.0% vs 76.0%; log-rank检验p = 0.025，HR无法评估），而在TMB ≤ 40 mut/Mb的患者中则不然（2年OS：80.0% vs 81.0%; HR = 0.65，95% CI：0.16–2.65， logrank p = 0.949; 图3B）。值得注意的是，在接受联合治疗的高TMB患者中，无人疾病进展或死亡。

图3. 不同ICI治疗方案/TMB（阈值40 mut/Mb）患者的（A）PFS和（B）OS Kaplan Meier曲线

不同TMB肿瘤对ICI的反应

分析了100例患者的治疗缓解情况。与接受抗PD-(L)1单药治疗的患者相比，接受抗CTLA-4联合治疗的患者CR率（36.7% vs 12.9%; OR = 3.92，95% CI = 1.41–10.89; p = 0.009）和客观缓解率（ORR）（83.3% vs 57.1%，OR = 3.75，95% CI = 1.29–10.94; p = 0.016）显著更高（图4A）。TMB > 23 mut/Mb的患者CR率（22.0% vs 0%，fisher p = 0.198）和ORR（OR = 4.28，95% CI：1.00–18.31，p = 0.050）高于TMB ≤ 23 mut/Mb的患者（图4B）。最后，接受抗CTLA-4联合治疗的TMB > 40 mut/Mb的患者CR率和ORR最高（图4C），治疗方案联合TMB状态与CR率显著相关（p = 0.0438），与ORR接近显著相关（p = 0.054）。

图4. RECIST疗效评估

讨 论 

本研究对接受ICI治疗的dMMR/MSI-H mCRC患者进行了回顾性分析，发现TMB较低的患者的结局较差，无论ICI治疗方案如何，而TMB较高的患者亚群，与抗PD-(L)1单药治疗相比，从抗PD-1/CTLA-4联合治疗中获益较多。

基于非随机研究结果，FDA批准了Foundation One CDx（伴随诊断）评估的TMB-H状态作为泛癌种标志物，指导经治晚期实体瘤患者帕博利珠单抗治疗选择。此外，有研究探索了在几种肿瘤类型中，TMB可否作为潜在的免疫治疗疗效预测标志物，发现TMB可能是影响抗PD-1治疗敏感性的重要因素。然而，在已有获批适应症的情况下，一些因素可能会阻碍TMB用于指导患者ICI治疗选择。其中，最相关的是阈值和NGS平台的异质性，以及缺乏前瞻性随机临床试验验证TMB的预测价值和临床效用。另外，突变的质量可能与数量一样重要，甚至更相关，因此除了TMB评估之外，还需要更准确的免疫原性预测。dMMR/MSI-H肿瘤的TMB通常高于10 Mut/mb，可以较好地预测突变免疫原性和新抗原载量。dMMR/MSI-H状态是经验证的免疫治疗疗效预测标志物，所有主要指南都推荐MSI检测用于指导mCRC的一线治疗选择，但未推荐TMB。

值得注意的是，在接受ICI治疗的患者中，有较高比例的患者出现早期疾病进展，这可能与原发性免疫耐药有关。体能状态较差、基线炎症指数高、腹水和在后线治疗使用ICI等临床因素可能与疾病快速进展率较高有关。

此外，还有几项研究探讨了MSI-H结直肠癌中可能与免疫“冷”表型相关的分子标志物。除了这些产生假设的转化研究之外，考虑到CGP的广泛应用，TMB显然是最有希望的生物标志物。Shrock等人的研究纳入了22例主要接受了抗PD-(L)1单药治疗的dMMR/MSI-H mCRC患者，发现TMB能够对治疗结果进行分层，最优阈值为37-41 Mut/Mb。

本研究证实，TMB较低的患者结局较差，有几个原因。首先，由于新表位数量有限，相对较低的TMB可能与肿瘤免疫原性较低有关，从而导致对ICI敏感性较低。此外，较低的TMB可能与dMMR / MSI-H肿瘤免疫编辑过程的克隆进化有关。与本研究结果一致的是，最近，对dMMR/MSI-H晚期胃癌患者进行的一项综合分析显示，在15例TMB可评估的接受帕博利珠单抗治疗的患者中，无应答者的中位TMB较低，TMB＜26 Mut/Mb与不良结局相关。本研究中，阈值为23 Mut/Mb，阈值的相似性支持进一步前瞻性验证最低TMB值作为预后或潜在预测标志物。根据本研究结果，我们不能正式表明，较低的TMB能够预测化疗疗效优于免疫治疗。随机临床试验KEYNOTE-177、SAMCO-PRODIGE54，以及正在进行的CheckMate 8HW等研究比较了ICI vs化疗在dMMR/MSI-H mCRC中的疗效，应对这类研究进行事后分析，评估TMB的预测价值。

本研究结果提示，未来研究可以探索抗PD-1药物联合免疫调节药物（包括化疗或抗血管生成药物，如贝伐珠单抗或多靶点酪氨酸激酶抑制剂）在TMB较低患者中的疗效，看能否改善长期生存，实现疾病治愈。相关NRG-GI 004/SWOG-S1610试验纳入了TMB较低的患者，比较了一线FOLFOX（5-氟尿嘧啶/奥沙利铂）/贝伐珠单抗/阿替利珠单抗vs阿替利珠单抗单药的疗效。此外，KEYSTEP-008试验（NCT04895722）正在探索联合下一代免疫检查点抑制剂（包括ILT4抑制剂（免疫球蛋白样转录本4抑制剂）、抗TIGIT（具有免疫球蛋白和ITIM结构域的抗T细胞免疫受体）、抗LAG3（抗淋巴细胞活化基因3））的方案。

与原发性耐药相比，现有试验的生存曲线及CheckMate 142试验更新的4年结果显示，很大一部分dMMR/MSI-H mCRC患者经ICI治疗，实现长期疾病控制甚至治愈。鉴于此，我们先前构建了一个列线图来估计长期治愈的概率，发现ICI治疗方案是影响结局的最强和关键决定因素。与此一致，在非随机研究中，抗CTLA-4联合治疗的原发性耐药率低，“治愈”率较高。

本研究还表明，在具有临床预后不良因素（如体能状态较差和炎症指数较高）的患者中，CTLA-4/PD-1双重阻断治疗可能较为有效。尽管临床因素具有潜在效用，但应识别和验证预测性生物标志物。本研究表明，TMB或可用于筛选从ICI双重阻断治疗中获益较多的患者，即TMB值较高（40 Mut/Mb或更高）的患者。在这些患者中，抗CTLA-4联合治疗与100%无事件状态相关。相比之下，TMB中等的患者加用抗CTLA-4药物似乎未改善临床结局，可能与不必要的毒性有关。因此，正在进行的比较一线和二线ICI单药vs联合治疗的随机试验，如CheckMate 8HW和KEYSTEP-008（NCT04895722），应验证较高TMB的预测作用。另一方面，考虑到联合治疗发生不良事件的风险较高，未来的研究应评估TMB等生物标志物以及多种临床因素，以指导抗PD-(L)1单药治疗vs抗CTLA-4联合治疗方案的选择。

虽然本研究证实了dMMR / MSI-H CRC的生物学异质性，但仅评估了TMB的影响，有其他相关研究评估了林奇综合征状态，特定MMR蛋白表达缺失，以及染色体拷贝数变异。因此，鉴于TMB可能仅是复杂的免疫谱的一部分，需要开展更多的研究，来更好地描述dMMR / MSI-H CRC异质性背后的生物学。虽然我们发现林奇综合征的存在似乎对生存有积极影响，但本研究不足以得出这一结论，需要纳入更多患者，分析与TMB，林奇综合征状态和特定MMR蛋白表达缺失的相关性。

本研究有几个局限。首先，本研究是回顾性研究。本研究纳入的患者数量较少，阈值的准确性和可重复性可能有限。由于缺乏外部验证和前瞻性研究验证，应谨慎解释本研究结果。然而，考虑到mCRC患者dMMR/MSI-H频率较低，据我们所知，这是文献中有可及且统一定义的TMB数据的最大队列。最后，由于有多个NGS平台，在常规临床实践中，TMB值的计算和阈值的协调是应用TMB需要解决的主要挑战。

总之，本研究使用TMB对dMMR/MSI-H mCRC患者进行了分层，区分了从不同ICI治疗方案中获益程度不同的人群。本研究表明，TMB可用于指导这类患者的治疗选择和未来临床试验设计，需要前瞻性研究来进一步验证这一结论。

参考文献：

Manca P, Corti F, Intini R, Mazzoli G, Miceli R, Germani MM, Bergamo F, Ambrosini M, Cristarella E, Cerantola R, Boccaccio C, Ricagno G, Ghelardi F, Randon G, Leoncini G, Milione M, Fassan M, Cremolini C, Lonardi S, Pietrantonio F. Tumour mutational burden as a biomarker in patients with mismatch repair deficient/microsatellite instability-high metastatic colorectal cancer treated with immune checkpoint inhibitors. Eur J Cancer. 2023 Mar 31;187:15-24. doi: 10.1016/j.ejca.2023.03.029. Epub ahead of print. PMID: 37099945.

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