快报 | 我国东部地区结核分枝杆菌进化与流行传播分析：一项前瞻性研究证据

作者：周宗磊，易槐明，周庆荣，王璐琦，朱月，王伟炳，柳正卫，熊海燕

第一作者及单位：周宗磊，复旦大学公共卫生学院；易槐明，常山县疾病预防控制中心；周庆荣，江山市疾病预防控制中心

通信作者及单位：王伟炳，复旦大学公共卫生学院，公共卫生安全教育部重点实验室；柳正卫，浙江省疾病预防控制中心

Evolution and epidemic success of Mycobacterium tuberculosis in eastern China: evidence from a prospective study

BMC Genomics, 2023, 24(1):241.

doi: 10.1186/s12864-023-09312-6.

PMID: 37147590.

研究背景

2021年，全球共新增结核病（TB）患者约1060万，相较2020年增加4.5%。其中，新发感染者中耐多药（MDR）和利福平耐药（RR）者比例为3.6%，而复治患者中该比例则高达18%。在全球范围内，我国MDR/RR患者数量位居第二，仅次于印度（27%），其次是俄罗斯（8%）。越来越多的证据提示具有耐药性的结核分枝杆菌（MTB）可导致结核病疫情扩散，因此了解耐药发生的分子机制具有重要意义。然而，自2020年世界卫生组织提出MDR/RR-TB最新定义以来，关于我国东部地区MTB耐药性分布（基于最新定义）及其进化的研究数据仍较少。此外，持续性的MTB传播意味着需要巨额的医疗卫生费用，因此识别出具有高传播风险的菌株对遏制疫情扩散具有重要价值。既往研究利用遗传距离和基本再生数方法分析了MTB的传播状况及影响因素，但这些方法不容易区分某些特异性菌株对传播的影响，且无法估计单一菌株的传播力。相反，时间尺度单倍型密度（THD）分析可获得菌株水平的传播情况，能较好地弥补以上方法的缺陷。因此，本研究旨在了解我国东部地区MTB菌群及耐药性演化历程，通过THD方法分析菌株传播水平并探讨相关遗传因素，从而为控制当地结核病疫情传播提供参考。

研究方法

本研究共纳入997份全基因测序样本，其中733 份（73.52%）样本来自浙江省。利用IQ-tree 2.2.0软件构建极大似然树进行菌株谱系识别，利用38个耐药相关基因的耐药突变位点来预测一线及二线药物的耐药情况。同时，使用TB-Profler 4.1.1软件对菌株谱系和耐药性进行验证以确保结果可靠性。本研究将药物耐药性划分为：敏感（sensitive）、non-MDR、MDR、准广泛耐药（pre-XDR）。其中，MDR是指对异烟肼和利福平均产生耐药，pre-XDR是指MDR菌株对任一氟喹诺酮类药物发生耐药，non-MDR包括利福平或异烟肼耐药以及不属于MDR、pre-XDR的其他耐药。使用BEAST 1.10.4软件基于马尔可夫-蒙特卡洛算法（MCMC）和GTR+ Γ4模型计算菌株的最近共祖时间（tMRCA），并绘制最大可信进化分枝树和天际线图。使用R软件中thd包计算各菌株的传播力指数，HomoplasyFinder包识别L2和L4谱系菌株的趋同进化位点。利用R软件进行统计学分析，Kruskal-Wallis H检验进行传播力指数的组间比较，P <0.05视为具有统计学差异。

研究结果

1.菌群谱系与遗传进化：997株MTB的平均测序深度为279.70±122.07X，平均覆盖度为98.81±1.21%。中国东部地区MTB以L2谱系为主（80.44%），其次为L4谱系（19.56%）。其中，L2谱系以L2.2亚谱系居多（99.88%），而L4谱系主要为L4.4（45.64%），其次是L4.5（43.08%）和L4.2（10.77%）（图1）。贝叶斯传播进化分析发现，L2和L4菌株的最早出现时间分别为7017年前和6882年前，其亚型L4.2、L4.5、L4.4菌株的最近共祖时间则分别为4565、3768、2430年前。此外，L2和L4谱系均在200年前开始扩张。

2.基因型耐药性及其演化：在997株MTB中，pre-XDR和MDR菌株分别占2.11%、5.12%，未发现贝达喹啉、德拉玛尼、利奈唑胺耐药的菌株。耐药率最高的一线治疗药物为异烟肼（15.25%），其次为链霉素（12.34%），而二线药物耐药最常见的是氟喹诺酮类（6.12%）。不同谱系菌株的耐药率不存在统计学差异（P >0.05）。贝叶斯进化分析结果显示，异烟肼耐药突变kat S315T 最早出现在65年前，其次是利福平耐药突变rpoB S450L（61年前）、链霉素耐药突变rpsL K43R（58年前）、乙胺丁醇耐药突变embB M306V（52年前）（图2）。补偿突变位点rpoA c.-68 C>T、rpoC G896C、ahpC S148R分别出现在46、53、40年前。

注：从外向内依次为谱系、耐药性、补偿突变位点、耐药突变位点

图1基于极大似然法构建的系统发育树

图2携带耐药突变和补偿突变菌株的最近共祖时间

3. 菌株传播力与耐药性：THD分析发现，L2和L4谱系菌株传播力指数的中位数分别为1.02、1.00，两者间不存统计学差异（P=0.306）。亚谱系L2.2、L4.2、L4.4、L4.5中位传播力指数分别为1.02、1.00、1.02和0.99。不同耐药性菌株的补偿突变率存在差异，最高的是pre-XDR菌株（76.19%），其次是MDR菌株（47.06%）。此外，携带补偿突变位点的pre-XDR菌株的耐药突变位点数量也相对较高（P=0.032）。进一步分析发现，不同耐药性菌株的传播力无明显差异（P=0.340），但携带补偿突变位点的pre-XDR菌株的传播力指数（中位数：1.09）高于未携带补偿突变位点的pre-XDR菌株（中位数：0.75，P=0.025）（图3）。

图3根据补偿突变划分的不同耐药性菌株的THD传播力指数

4. 菌株传播的遗传学因素：趋同进化分析发现，L2谱系菌株共存在3333个潜在阳性选择位点，其中85个位点位于耐药基因；L4谱系菌株共发现693个潜在阳性选择位点，其中位于耐药基因的有24个；L2和L4谱系其余的趋同突变位点则分别分布在1569、317个基因中。此外，我们发现了5个位点位于二线注射类药物耐药基因（whiB6），以及位于prpR和dnaA基因的突变位点，后两者基因突变可分别导致条件性耐药和异烟肼耐药。

研究结论

我国东部地区L2和L4谱系MTB均处于扩散阶段，且具有类似的传播力。该地区菌株存在耐药突变积累的现象，但这些耐药突变并未显著改变菌株传播力。另外，补偿突变位点数量与耐药突变位点数量存在正相关关系，并可促进pre-XDR菌株扩散。建议进一步开展pre-XDR/XDR和L4谱系菌株分子监测以期为结核病防控政策的制定提供科学依据。

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供稿：周宗磊

编辑：于   菲

审校：范永德

发布日期：2023-05-18