科研丨南中医＆中国药科大学: 肠道共生狄氏副拟杆菌可减轻炎症性关节炎(国人佳作)

编译：微科盟溧阳，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

肠道菌群失调与类风湿关节炎(RA)的发病密切相关。本文旨在确定可以改善RA发展的潜在肠道微生物。通过16S rDNA细菌基因测序和鸟枪宏基因组学研究了RA患者和健康个体的微生物谱。通过胶原蛋白诱导关节炎(CIA)小鼠和TNF-α转基因小鼠，探究肠道共生Parabacteroides distasonis在RA中的作用。同时还研究了P. distasonis衍生的代谢物对CD4+ T细胞分化和巨噬细胞极化的影响。结果发现，在新发RA患者和有病史的RA患者中P. distasonis的相对丰度下降，并且这种降低与疾病活动评分-28(DAS28)呈负相关。用P. distasonis(LPD)治疗关节炎小鼠显著改善了RA的发病机制。LPD衍生的石胆酸(LCA)、脱氧胆酸(DCA)、isoLCA和3-oxoLCA在治疗RA方面具有相似且协同的作用。除了直接抑制Th17细胞的分化外，3-oxoLCA和isoLCA被鉴定为TGR5激动剂，可促进M2巨噬细胞极化。胆盐水解酶的一种特异性合成抑制剂通过减少这四种胆汁酸的产生来减弱LPD的抗关节炎作用。天然产物人参皂苷Rg2通过促进P. distasonis的生长发挥抗RA作用。综上所述，P. distasonis和人参皂苷Rg2可能是治疗RA的益生菌和益生元制剂。

论文ID

原名：Gut commensal Parabacteroides distasonis alleviates inflammatory arthritis

译名：肠道共生狄氏副拟杆菌可减轻炎症性关节炎

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2023.1

通讯作者：单进军，李菁，李永明，周伟

通讯作者单位：南京中医药大学医学代谢组学中心；中国药科大学生命科学与技术学院；南京中医药大学医学院•整合医学学院；中国药科大学中药学院

DOI号：10.1136/gutjnl-2022-327756

实验设计

结果

1. 类风湿关节炎患者肠道菌群分析

为了确定肠道微生物组改变与RA发病机制之间的关系，我们比较了37名RA受试者和13名健康对照的粪便样本的肠道微生物组成。如图1A-D所示，RA患者与健康受试者在微生物的门和属水平上存在显著差异。在门水平上，RA患者拟杆菌门的相对丰度增加，疣微菌门的相对丰度下降(图1A，B)。在属水平上，RA患者Collinsella、Erysipelothichaceae、Roseburia、Dorea、Erysipelatoclostridium、Faecalibacterium、Bacteroides、Subdoligranulum、Alistipes、Coprococcus、Parabacteroides和Blautia的相对丰度降低，而Bifidobacterium、Agathobacter、Akkermansia、Ruminococcus和Veillonella的相对丰度升高(图1C，D)。重要的是，我们发现Parabacteroides的相对丰度与疾病活动评分-28呈负相关(DAS28，r=−0.77，p=6.90×10−5)。此外，我们对22名健康受试者和25名新发RA患者粪便样品进行鸟枪宏基因组学研究，在Parabacteroides属下发现了19个差异种，值得注意的是，P. distasonis的相对丰度在RA患者粪便样本中减少了2.17倍(图1E)，并且P. distasonis的相对丰度与DAS28呈负相关(r=-0.79, p=2.41×10−6)(图1F)。此外，qPCR结果显示，新发RA患者和有疾病史的RA患者中P. distasonis丰度显著降低(图1G，H，1I-K)。RA患者P. distasonis的相对丰度与DAS28呈负相关(r=−0.64，p=4.09×10−1)。因此，P. distasonis失调可能与RA的病理进展有关。

图1

类风湿关节炎患者肠道菌群分析。(A，B)通过16S rDNA细菌基因测序分析微生物群1中有病史的RA患者(n=37)和健康受试者(n=13)在门水平上的细菌相对丰度(占总细菌的百分比)；(C，D)RA患者(n=37)和健康受试者(n=13)在属水平上的细菌相对丰度；(E)火山图显示了25个新发RA患者与22个健康受试者肠道菌群物种丰富程度的差异，这些微生物群2是用鸟枪宏基因组学分析的。蓝点表示下调的物种，红点表示上调的物种；(F) Pearson分析P. disasonis相对丰度与DAS28之间的相关性；(G)采用qPCR方法分析微生物群验证集1中新发RA患者(n=20)和健康受试者(n=19) P. disasonis的相对丰度；(H)采用qPCR方法分析微生物群验证集2中新发RA患者(n=20)和健康受试者(n=19) P. disasonis的相对丰度；(I)采用qPCR方法分析微生物群验证集3中有病史的RA患者(n=20)和健康受试者(n=19) P. disasonis的相对丰度；(J)采用qPCR方法分析微生物群验证集4中有病史的RA患者(n=20)和健康受试者(n=19) P. disasonis的相对丰度；(K)采用qPCR方法分析微生物群验证集5中有病史的RA患者(n=19)和健康受试者(n=17) P. disasonis的相对丰度。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。  

2.P.disasonis可减轻两种RA模型的炎症性关节炎严重程度

与RA患者的结果一致，我们发现P. disasonis在CIA小鼠中丰度较低。口服LPD可提高CIA小鼠肠道的P. disasonis丰度。免疫后1周，CIA小鼠P. disasonis丰度降低，LPD治疗4周可恢复并上调P. disasonis丰度。P. distasonis的相对丰度在热杀死P. distasonis(KPD)处理的CIA小鼠中保持不变。16S rDNA细菌基因测序、主坐标分析和系统发育树进一步证实，LPD或KPD处理没有改变肠道菌群组成，这表明LPD通过直接增加肠道中P. disasonis的丰度来预防RA。

从临床评分(图2A)、发病率(图2B)和后爪肿胀(图2C，D)等方面来看，口服LPD(而非KPD)可减轻CIA小鼠的RA症状。同时，如micro-CT(图2E-F)和组织病理学数据(图2G-H)所示，LPD改善了CIA小鼠关节中观察到的滑膜细胞增殖、滑膜细胞侵蚀、血管翳形成、炎性浸润和骨侵蚀等症状。为了确定P. disasonis的保护作用是否需要其他肠道微生物的参与，在口服P. disasonis之前使用联合抗生素消融肠道微生物群。结果表明，肠道微生物的缺失减弱了P. disasonis在RA中的作用，表明其他肠道微生物参与了P. disasonis对RA的有益作用。

此外，LPD治疗通过降低CIA小鼠MCP-1、RANKL、MMP3、OB-cadherin和IL-17A的表达，有效地减轻了关节炎症(图3)。在CIA小鼠中观察到血清中高表达的自身抗体，而LPD处理后小鼠血清中IgG1和抗CII IgG水平正常化。更重要的是，LPD在TNF-α转基因小鼠中也显示出类似的抗关节炎保护作用。

图2

口服LPD可减轻CIA小鼠的RA严重程度。(A) CIA小鼠关节炎临床评分(n≥8)；(B)关节炎发病率(n≥8)；(C，D)第42天(n≥8)各组后爪照片及相应后爪厚度数据；(E，F) CIA小鼠代表性后爪micro-CT图像及micro-CT图像评分(n=3)；(G，H) H&E染色显微照片和滑膜细胞增殖、滑膜细胞侵蚀、血管翳形成、炎症浸润和骨侵蚀的组织学评分(n=6)。

图3

口服LPD可降低CIA小鼠关节炎症细胞因子的表达。(A)免疫后第42天取各组小鼠的后爪切片，用免疫组化(IHC)法对抗MCP-1抗体、抗RANKL抗体、抗MMP-3抗体、抗OB-cadherin抗体和抗IL-17A抗体染色分析；(B)相应阳性细胞的定量。

3.LPD调节CIA小鼠的炎症细胞因子

与对照组小鼠相比，CIA小鼠的IL-17A、IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，但结肠组织和血液中的IL-10水平下降。这些炎症特征在给药LPD后基本逆转。此外，我们发现LPD降低了CIA小鼠结肠中RORγt的蛋白表达。LPD处理后小鼠脾脏中Th17细胞相关细胞因子(Il6、Il21、Il22、Il17a、Il17f、Il1b、Tnf)及其转录因子Rorc的mRNA水平明显受到抑制。相反，抗炎细胞因子Il10和Foxp3的mRNA水平在接受LPD处理的CIA小鼠中显著升高。与此同时，LPD处理改善了CIA小鼠的肠系膜淋巴结(MLNs)中Th17/Treg失衡和促炎因子的过度产生。

4.LPD可预防CIA小鼠肠道渗漏和代谢性内毒素血症

与健康对照相比，CIA小鼠和RA受试者的血清LPS水平上调(图4A，B)。口服LPD后CIA小鼠的LPS水平几乎恢复正常(图4A)。结肠组织染色显示LPD能够维持肠道上皮屏障功能(图4C，D)。LPD改善肠道上皮屏障与紧密连接分子(ZO-1和occludin)的上调有关(图4E-G)。免疫组化结果显示，RA小鼠occludin和ZO-1的上皮表达被抑制，但LPD可使其恢复(图4H-K)。

图4

LPD可预防肠道渗漏和代谢性内毒素血症。(A)小鼠血清脂多糖(LPS)浓度(n=7)；(B) RA患者(n=45)和健康受试者(n=40)的血清LPS浓度；(C，D)结肠黏膜上皮细胞变性坏死、肠腔炎性细胞渗出、固有层炎性细胞浸润的H&E染色显微照片及组织学评分(n=6)；(E-G) Western blot检测结肠ZO-1和occludin表达(n=3)；(H，K)结肠occludin免疫组化表达(n=5)；(I，J)结肠ZO-1免疫组化表达(n=5)。*与模型或RA相比，p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。与KPD相比，︿p＜0.05，︿︿p＜0.01，︿︿︿p＜0.001，︿︿︿︿p＜0.0001。

5.P.disasonis促进CIA小鼠的次级胆汁酸代谢

通过靶向代谢组学，我们发现RA患者粪便样本中次级胆汁酸(DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA)的水平显著降低(图3A)。与TCA(100 μM)和TCDCA(100 μM)共培养的P. distasonis分别产生CA和鹅去氧胆酸(CDCA)。与LCA(100 μM)共培养的P. distasonis产生了3-oxoLCA和isoLCA。与3-oxoLCA(100 μM)共培养的P. distasonis产生了isoLCA和LCA，因为这种细菌含有3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSDH)和3α-HSDH。此外，我们发现CIA小鼠中次级胆汁酸(DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA)的含量降低，但LPD治疗后上调。为了进一步确认P. disasonis是否通过调节3-oxoLCA、isoLCA、LCA和DCA的产生来影响关节炎的发展，使用特定的BSH抑制剂(化合物5)抑制这四种胆汁酸的合成。果然，P. disasonis在化合物5存在的情况下，以TCA和TCDCA为底物，不产生DCA和LCA。此外，化合物5的预处理消除了P. disasonis的有利作用。与此同时，DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA的产生减少。因此，P. disasonis可能作用于DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA从而引起其抗RA作用。

6.3-oxoLCA、isoLCA、DCA和LCA反映了P. disasonis的有利作用

在CIA小鼠中，3-oxoLCA和isoLCA均减轻了关节炎损伤的严重程度，降低炎症评分，骨和软骨损伤得到改善(图5)。这些现象均伴有关节炎症标志物的下调和体液免疫反应的抑制，结肠、血液、脾脏和MLNs炎症因子水平的下降，维持了肠道上皮屏障完整性。同时，外源性DCA和LCA处理CIA小鼠对RA具有保护作用(图6)。这些数据共同表明，关节炎小鼠中P. disasonis的正常化介导了四种胆汁酸的保护作用。为了评估单一胆汁酸或胆汁酸组合的作用，我们给RA小鼠注射了低剂量的DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA及其组合。结果表明，单独低剂量DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA能有效改善RA小鼠的症状，而它们的联合治疗效果更好。从micro-CT和组织学数据来看，DCA和LCA的保护作用可能低于3-oxoLCA和isoLCA。

图5 

3-oxoLCA和isoLCA反映了P. disasonis对CIA小鼠的有益作用。(A) CIA小鼠的关节炎临床评分(n≥8)；(B)关节炎发病率(n≥8)；(C，D)第42天各组后爪代表性照片及相应后爪厚度数据(n≥8)；(E，F) CIA小鼠代表性后爪micro-CT图像；(G，H)基于滑膜细胞增殖、滑膜细胞侵蚀、血管翳形成、炎症浸润和骨侵蚀的H&E染色显微图片和组织学评分(n=6)。

图6

DCA、LCA和Rg2反映了P. disasonis对CIA小鼠的有益作用。(A) CIA小鼠的关节炎临床评分(n≥8)；(B)关节炎发病率(n≥8)；(D，E)第42天各组后爪照片及相应后爪厚度数据(n≥8)；(F，G) CIA小鼠代表性后爪micro-CT图像(n=3)；(H，I)基于滑膜细胞增殖、滑膜细胞侵蚀、滑膜形成、炎症浸润和骨侵蚀的H&E染色显微图片和组织学评分(n=6)。  

7.LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA对Th17/Treg细胞体外分化的影响

为了表征LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA处理后活化的naive T细胞的表型，我们分离并制备了脾CD4+ T细胞，并建立了Th17和Treg细胞分化模型。我们发现3-oxoLCA和isoLCA对Th17细胞分化有抑制作用，而DCA和LCA对Th17细胞分化无影响。我们进一步发现3-oxoLCA和isoLCA抑制分化T细胞中RORγt的蛋白表达，而DCA和LCA不抑制。在Il17和Il22的mRNA水平上也观察到类似的结果。流式细胞仪检测结果显示，3-oxoLCA、isoLCA、DCA和LCA对Treg细胞的分化无影响，Foxp3蛋白表达及Il10和Tgfb mRNA水平也均无影响。

8.LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA对体外巨噬细胞极化的影响

研究发现3-oxoLCA和isoLCA可在细胞和动物水平上抑制Th17细胞分化，而DCA和LCA仅能在体内抑制Th17细胞分化。这一发现促使我们探索DCA和LCA是否可以在体外以另一种方式抑制Th17细胞分化。巨噬细胞向M2型极化足以抑制促炎Th17细胞反应。用LPS孵育RAW264.7细胞导致CD86+细胞以及Il6和CD86的mRNA水平急剧升高，M1巨噬细胞分化，其被3-oxoLCA、isoLCA、DCA和LCA消除(图7A-C)。IL-4刺激后，CD206阳性细胞明显增加，并且这种效应在LCA、DCA、3-oxoLCA和IsoLCA的存在下增强(图7E-F)，这表明LCA、DCA、3-oxoLCA和IsoLCA促进了M2型巨噬细胞转化。通过测量Arg1和Mrc1 mRNA水平进一步证实了这一点(图7G)。

武田G蛋白偶联受体5(TGR5)对各种胆汁酸具有不同的亲和力，其中LCA的亲和力最高，其次是DCA、CDCA和胆酸(CA)。我们的结果表明，3-oxoLCA和isoLCA是TGR5的潜在配体，具有高结合能(3-oxoLCA为−8.71 kcal/mol，isoLCA为−9.09 kcal/mol，LCA为−9.32 kcal/mol，DCA为−8.05 kcal/mol)。LPS抑制了TGR5的蛋白表达，而LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA恢复了其表达(图7D)。TGR5的沉默阻止了LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA对Il6和CD86 mRNA水平的抑制作用。同样，LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA需要并上调TGR5来促进M2巨噬细胞的极化(图7H)。这些结果表明，LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA通过TGR5信号通路抑制M1巨噬细胞极化并促进M2巨噬细胞极化。接下来我们探讨了LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA是否通过M2巨噬细胞影响Th17细胞的分化，结果发现Th17细胞的分化明显受到抑制。

图7

LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA或其组合对巨噬细胞极化的影响。(A，B) LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA或其组合对M1巨噬细胞百分比影响的代表性图像及定量分析；(C) M2巨噬细胞相关标志物，如Il6和Cd86的mRNA水平；(D) Western blot检测TGR5蛋白表达；(E，F) LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA或其组合对M2巨噬细胞百分比影响的代表性图像及定量分析；(G) M1巨噬细胞相关标志物，如Arg1和Mrc1的mRNA水平；(H) Western blot检测TGR5蛋白表达。

9.筛选通过促进P. distasonis生长改善RA的调节剂

由于口服皂苷的生物利用度较低，其多种生物学和药理作用可能是由肠道微生物群介导的。因此，我们从皂苷质谱数据库获得了112种天然皂苷，筛选可能促进P. disasonis生长的候选基因。结果表明，人参皂苷Rg2对P. distasonis生长的促进作用最强。口服Rg2可恢复CIA小鼠和TNF-α转基因小鼠粪便样本中P. disasonis的积累(图6C)。Rg2可改善CIA小鼠(图6)和TNF-α转基因小鼠的病理指标。因此，作为一种益生元制剂，Rg2通过促进P. distasonis的生长在关节炎小鼠中发挥治疗作用。

10.LPD、LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA和Rg2对体内Th17/Treg细胞的影响

在P.distasonis、LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA和Rg2治疗后，研究人员使用流式细胞术研究了小鼠脾脏中Th17和Treg细胞之间的失衡。与CIA小鼠相比，P. distasonis导致脾脏Th17细胞显著减少至接近对照小鼠的水平(图6A，C)。此外，LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA和Rg2下调了关节炎小鼠脾脏组织中Th17细胞的百分比，而LCA和DCA对Th17细胞抑制作用略弱(图6A，C)。相反，CIA小鼠脾脏中Treg细胞的比例显著降低，但通过LPD、LCA、3-oxoLCA、isoLCA和Rg2可以恢复(图6B，D)。同时，在CIA小鼠的MLN、CLPL中观察到更大比例的Th17细胞和更低水平的Treg细胞，这些效应被LPD、LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA和Rg2消除。

图8

LPD、LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA和Rg2对脾脏Th17和Treg细胞比例的影响。(A，C) LPD、LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA、Rg2对脾脏Th17细胞比例影响的代表性图像及定量分析；(B，D) LPD、LCA、DCA、3-oxoLCA、isoLCA、Rg2对脾脏Treg细胞比例影响的代表性图像及定量分析。

讨论

本研究的主要结果可以总结为：(1)肠道微生物P. distasonis的相对丰度在RA患者的粪便样本中明显减少；(2) P. disasonis及其代谢物(3-oxoLCA、isoLCA、LCA和DCA)通过改变Th17/Treg细胞平衡，中和致病自身抗体，改善肠道通透性，从而降低小鼠对RA的敏感性；(3)除抑制RORγt介导的Th17细胞分化外，3-oxoLCA和isoLCA是TGR5激动剂，可促进M2型巨噬细胞极化；(4)药物筛选和额外的药理实验结果表明人参皂苷Rg2是一种潜在的益生元，具有类似的抗RA作用。

肠道微生物组在类风湿性关节炎的发生和发展中日益成为一个关键的角色。研究表明，肠道菌群组成的变化与类风湿关节炎的病理生理学有关。因此，补充益生菌或抑制致病性肠道细菌可能是风湿性关节炎的替代治疗方法或补充现有的治疗方案。本研究的结果表明RA受试者P. disasonis丰度下降，且与DAS28呈负相关。大量证据表明，P. disasonis在治疗代谢功能障碍、结直肠肿瘤发生和热量限制后体重快速增加方面发挥了有益作用。口服P. disasonis可改善CIA和TNF-α转基因小鼠的RA症状。表明P. disasonis可能是一种很有前景的治疗类风湿关节炎的益生菌。

在RA患者中，Th17/Treg平衡偏向于Th17细胞，导致自身免疫和全身炎症的发生。改善Th17/Treg细胞平衡是治疗实验性关节炎的重要策略。流式细胞术结果显示P. disasonis治疗纠正了脾脏、MLNs和CLNs中的Th17/Treg失衡。越来越多的证据表明，肠道上皮屏障紊乱与肠道菌群失调和类风湿关节炎的发生有关。紧密连接蛋白完整性的恢复可以改善RA。在当前的研究中，我们发现RA患者和CIA小鼠血清中的LPS水平较高，但P. disasonis处理能够很大程度降低血清中升高的LPS水平。此外，P. disasonis治疗通过上调ZO-1和occludin改善肠道上皮屏障功能。这些结果表明P. distasonis可能通过靶向调节肠上皮屏障功能预防关节炎的发生和发展。

人类胃肠道中常见的细菌能够调节胆汁酸的代谢。通过靶向代谢组学，我们发现RA患者粪便中的次级胆汁酸(DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA)水平较低。LPD显著提高了小鼠次级胆汁酸的产生，包括DCA、LCA、3-oxoLCA和isoLCA。外源应用四种次级胆汁酸对类风湿关节炎表现出单独和协同的保护作用，3-oxoLCA和isoLCA似乎比LCA和DCA更有效地治疗关节炎小鼠。LCA和DCA作用于TGR5影响巨噬细胞的极化，进而抑制Th17细胞分化。3-oxoLCA和isoLCA作为TGR5激动剂，在体外可通过两种方式抑制Th17细胞分化。一方面，它们直接抑制了驱动Th17细胞分化的RORγt的表达。另一方面，促进了M2巨噬细胞的极化，进而间接抑制Th17细胞的分化。重要的是，外源应用特定的合成BSH抑制剂减弱了P. distasonis对3-oxoLCA、isoLCA、LCA和DCA的产生影响，降低了P. distasonis在关节炎中的益处。这些发现支持了P. distasonis通过胃肠道产生3-oxoLCA、isoLCA、LCA和DCA来诱导其抗RA作用。

综上所述，P. distasonis及其相关代谢物(DCA、LCA、3oxoLCA和isoLCA)是治疗RA的潜在有效药物(图9)。此外，天然产物Rg2通过促进P. distasonis的生长，显示出良好的预防RA发展的能力。本研究将肠道微生物P. distasonis作为益生菌，人参皂苷Rg2作为益生元治疗类风湿性关节炎。

图9

Parabacteroides distasonis改善RA的潜在机制。RA患者和关节炎小鼠P. distasonis丰度较低，补充P. distasonis对实验性关节炎的保护作用是通过肠道中LCA、DCA、3-oxoLCA和isoLCA的产生从而恢复Th17/Treg细胞平衡。LCA和DCA作用于TGR5启动M2-型巨噬细胞极化，进而间接抑制Th17细胞的分化。除直接抑制RORγt介导的Th17细胞分化外，3-oxoLCA和isoLCA作为潜在的TGR5激动剂，促进M2-型巨噬细胞极化，进而抑制Th17细胞分化。Rg2是一种很有前景的益生元制剂，可以通过促进P. distasonis生长来治疗RA。