【中西合璧】接受针刺治疗的偏头痛患者的循环外泌体microRNA谱:一项安慰剂对照临床试验

上海中医药大学附属岳阳医院麻醉科

背景  

偏头痛是世界上第六大常见病症和第二大致残病症，是一种慢性神经系统疾病，其特征是反复发作的头痛，通常是单侧、搏动性，并伴有畏光、恶心和呕吐。尽管治疗偏头痛的药物有所改进，但患者常常因为药物产生的不良反应而感到担忧。针刺作为一种有效的偏头痛非药物疗法，没有严重的副作用，但在研究过程中，缺乏可用于预测针刺疗效的血液和遗传生物标志物。而外泌体miRNA可以充当有价值的非侵入性生物标志物，可以对其进行客观测量，以协助偏头痛的诊断，提高对其发病机制的理解，并确定其对治疗的潜在反应。

本研究旨在探讨针刺是否可以调节无先兆偏头痛(MWoA)患者与健康对照者(HCs)之间差异表达的外泌体miRNA。此外，还旨在确定有助于区分MWoA患者与HCs对照者的诊断生物标志物，并确定有助于预测针刺效果预后的生物标志物。该研究成果发表在2023年1月的FRONTIERS IN MOLECULAR NEUROSCIENCE（IF=6.26）杂志上，中西合璧专栏对该文献进行了编译，以飨读者。

方法  

该研究纳入2020年8月至2022年5月期间从四川省人民医院和成都中医药大学医院招募了63例符合国际头痛疾病分类MWoA诊断标准的患者(国际头痛学会头痛分类委员会(IHS)、2018年)。

纳入方法：(i)年龄在18至55岁之间，并且在50岁之前首次出现偏头痛；(ii)在过去3个月和基线期间经历过2到8次偏头痛发作，但每月少于15天；(iii)偏头痛发作超过一年；(iv)已完成头痛日记并提供基线值；(v)基线时VAS疼痛等级为3至7；(vi)在过去3个月内没有接受过任何针刺治疗。

排除方法：(i)紧张型头痛、丛集性头痛或其他原发性头痛；继发性头痛症；面部或头部的神经痛;(ii)较严重的全身性疾病（心血管疾病、急性传染性肝病、内分泌失调、过敏或甲亢）；(iii)严重的精神疾病，如严重的焦虑和抑郁；(iv)怀孕、哺乳或避孕不充分；(v)参与其他临床试验；(vi)无法阅读和理解评估量表。

研究方案：使用集中随机化，MWoA患者被随机分配到两组，真针刺治疗(trAMWoA)和假针刺治疗(shAMWoA)，比例为1:1。另外从社区招募了32名年龄和性别匹配的HC。在参加试验之前，已获得所有参与者的书面知情同意书。

干预措施：trAMWoA组和HC接受TA治疗，而shAMWoA组接受SA治疗。TA和SA处理均根据先前公开的方案进行，并由具有5年以上经验丰富的临床医生进行针刺治疗。每根针都被刺入并留在原处30分钟。在4周的时间内，所有受试者每周接受3次治疗。trAMWoA和shAMWoA组的患者被要求不要服用任何预防偏头痛的药物，但如果他们有严重的偏头痛（VAS评分>8），则允许使用布洛芬（300毫克缓释胶囊）作为抢救药物。

主要观测指标：（1）临床结果测量：偏头痛发作的频率;偏头痛发作的平均持续时间;疼痛的视觉模拟量表（VAS）评估;无法学习、工作或做家务的时间;偏头痛特异性QoL问卷（MSQ）;和头痛影响测试-6（HIT-6）量表用于测量MWoA患者感兴趣的临床结果。TA组的临床结果在基线期间和4周的TA治疗过程后进行测量，SA组的临床结果在基线期间和4周的SA治疗过程后进行测量。（2）血清采集：每组随机抽取10名受试者，在真或假针刺治疗前后立即于上午8：00-10：00在成都中医药大学医院采集空腹血标本。对于trAMWoA和shAMWoA组中的患者，我们在发作间期（≥24小时无头痛）收集血液样品。通过以3，000 rpm离心15 min提取血清，并立即在-80°C下储存。

miRNA测序及生物信息学分析：将血清外泌体进行分离和表征，通过RNA测序对外泌体进行miRNA分析，对miRNA测序数据分析，对靶基因预测和功能分析，进行实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）以确认候选miRNA表达的变化。

统计分析：使用SPSS26.0版和Prism9.0。双尾Studentt检验用于正态分布连续数据的组间比较，Mann-WhitneyU检验用于非正态分布连续数据的组间比较。使用Wilcoxon符号秩检验比较4周治疗前后trAMWoA和shAMWoA中记录的非正态分布临床结果数据。配对t检验用于比较在治疗4周之前和之后在trAMWoA和shAMWoA中记录的正态分布的临床结果数据。如果基线特征呈正态分布，计划使用协方差分析来检测HC、trAMWoA和shAMWoA组之间的差异;如果没有，计划使用Kruskal-Wallis检验。统计学显著性设定为p<0.05。Pearson相关分析用于评估miRNA与临床表型之间的相关性。

结果  

研究队列与针刺治疗偏头痛：trAMWoA组和shAMWoA组在头痛概况、HIT-6评分、MSQ量表评分和偏头痛症状方面无统计学意义差异（表1）。此外，我们为这项研究招募了32名年龄和性别匹配的HC，并排除了其中的2名（图1A）。研究参与者的人口统计学和临床特征见表1。

图1参与者的招募和排除如图1A所示，整体实验设计见图1B，trAMWoA和shAMWoA在基线和治疗4周后的临床结果见图1C

表1研究参与者的人口统计学和临床特征。    

trAMWoA组和HC组接受TA治疗，而shAMWoA组接受SA治疗。我们评估了MWoA患者在4周治疗前后的临床结局。trAMWoA和shAMWoA组的患者在4周的治疗期间没有服用任何药物。trAMWoA组和shAMWoA组的这些患者在人口统计学和临床特征方面没有统计学上的显着差异。

从MWoA和HC组的血清中分离了外泌体，TEM结果显示，MWoA患者的血清外泌体大小范围为50至150 nm（图2A）。此外，纳米颗粒跟踪分析显示，MWoA患者和HC参与者的外泌体平均大小分别为72.04 nm和83.57 nm（图2B）。MWoA患者和HC之间未观察到形态或颗粒数差异。WB证实这些样品中存在外泌体标志物CD9和TSG101蛋白（图2C）。

图2MWoA，无先兆的偏头痛患者;HC，健康控制;TA，真正的针刺;SA，假针刺。

在针刺治疗前后对MWoA患者和HC志愿者的外泌体进行了小RNA测序。在所有样品中获得了561个miRNA，其中443、426、437、429和449分别分布在HCs、治疗前MWoA患者、TA治疗后HCs、TA治疗后trAMWoA和SA治疗后的shAMWoA（图2D，E）。在HC和MWoA患者中一致检测到388个miRNA，在HC中特异性检测到55个miRNA，在MWoA患者中特异性检测到38个miRNA（图2D）。图2E显示，在TA和SA治疗之前和之后，分别在HC，trAMWoA和shAMWoA队列中检测到437，426和436。在TA和SA治疗前后，HC，trAMWoA和shAMWoA队列中的10个高表达miRNA几乎相同。同时，HCs和MWoA患者之间的10种高表达miRNA几乎相同。

与HC相比，MWoA患者中有104种不同的miRNA下调，而68种不同的miRNA上调（图3A）。TA治疗在HC中上调了49个miRNA，下调了80个miRNA，而在trAMWoA中上调了21个miRNA，下调了9个miRNA（图3B，C）。此外，SA处理在shAMWoA中上调了50个miRNA，下调了35个miRNA（图3D）。

图3MWoA患者和HC志愿者治疗前后DEmiR的火山图和维恩图

为了确定MWoA患者的潜在诊断和预后生物标志物，计算了12种外泌体miRNA表达与MWoA患者临床表型之间的Pearson相关性。发现前六种miRNA是has-miR-4732-5p，has-miR-369-5p，has-miR-5010-3p，has-miR-375，has-miR-550a-3-5p和has-miR-145-5p（图4A）。接下来，我们分析了这六种miRNA作为MWoA患者诊断生物标志物的预测能力，预测精度在0.83至1之间（表2）。当我们评估外泌体miRNA对MWoA患者的TA治疗的预后价值时，前五名miRNA（has-miR-369-5p，has-miR-378c，has-miR-5010-3p，has-miR-145-5p和has-miR-1292-5p）显示出高重要性（图4B）和预测能力（范围在0.89和1之间，表2）。TA和SA处理后这五种miRNA的表达水平变化如图4C所示。值得注意的是，三种miRNA，has-miR-369-5p，has-miR-145-5p和has-miR-5010-3p被发现具有诊断和预后标志物的潜力。我们应用机器学习方法基于这三种miRNA构建RF模型，并分析了它们组合的性能。我们并不感到惊讶，基于这三种miRNA的组合，机器学习模型在预测MWoA方面具有很高的准确性（准确性：1;95%CI：0.88-1;p<0.0001）和评估MWoA患者的TA治疗（准确性：1;95%CI：0.82-1;p=0.011）（图4D）。

图4MWoA患者的潜在诊断和预后生物标志物

表2血清外泌体miRNA对MWoA患者诊断和预后的预测能力

根据测序数据显示，与HC志愿者相比，MWoA患者中has-let-7b下调，这与先前研究的结果一致。在预测TA治疗调控的DEmiR靶基因在HCs和MWoA患者中。发现，与HCs相比，has-miR-145-5p，has-miR-378a-5p和has-miR-550a-3-5p下调，而has-miR-369-5p和has-miR-605-3p在MWoA患者中上调。因此，推断TA可能通过调节靶向偏头痛相关基因的miRNA对偏头痛产生治疗作用。

表3靶向偏头痛相关基因的miRNA

为了验证筛选出的诊断和预后生物标志物，采用RT-qPCR检查了TA治疗前后MWoA患者和HC志愿者血清外泌体中的miRNA表达水平。我们选择了has-miR-369-5p，has-miR-4732-5p，has-miR-550a-3-5p和has-mir-145-5p进行进一步验证。测序结果说明了四种外泌体miRNA的差异miRNA表达谱（图5）。RT-qPCR显示，相对于HCs，MWoA患者的has-miR-369-5p上调，TA治疗后下调。相对于HC组，MWoA患者的Hsa-miR-4732-5p，has-miR-550a-3-5p和has-mir-145-5p下调，并在TA治疗后上调。qPCR结果显示出与miRNA测序结果相同的趋势（图5）。

图5has-miR-369-5p、has-miR-4732-5p、has-miR-550a-3-5p和has-mir-145-5p的miRNA测序结果和qPCR结果

讨论

这是第一项确定可能的外泌体miRNA靶标的研究，表明针刺的功效，并检查这些外泌体miRNA作为诊断和预后生物标志物的准确性。本研究从外泌体miRNA的角度进一步探索偏头痛的诊断和预后生物标志物提供了依据。

在这项研究中，4周治疗前后在HC，trAMWoA和shAMWoA组中检测到外泌体miRNA。HCs和MWoA患者之间的DEmiR主要富集在PI3K-Akt，Hippo，FoxO和p53信号通路中。此外，TA在MWoA患者中发挥了治疗作用，可能是通过调节PI3K-Akt，Hippo和FoxO信号通路。确定了12种外泌体miRNA，这些miRNA对MWoA患者的TA治疗具有特异性。其中，has-miR-378a-5p与偏头痛导致无法工作、学习或做家务的时间呈显著正相关，has-miR-605-3p与MSQ的限制性分量表呈显著负相关。在之前的一项研究中，没有miRNA表达水平与偏头痛患者的头痛特征相关，miR-126水平与主要偏头痛症状的总数相关。值得注意的是，has-miR-605-3p靶向COL4A1，PNKD，TGFBR2和YAP1，它们已被确定为偏头痛患者的易感基因。

如上所述，has-miR-369-5p、has-miR-145-5p和has-miR-5010-3p可作为诊断和预后标志物。此外，对has-miR-369-5p，has-miR-145-5p和has-miR-5010-3p组合的评估可以提高准确性。

应该注意的是，据报道miR-369-5p靶向DNMT3A，DNMT3A的过表达可以显着降低TRPV1表达。其他三种外泌体miRNA，包括has-miR-550a-3-5p，has-miR-375和has-miR-4732-5p可以被视为诊断标志物。miR-550a-3-5p特异性靶向YAP1，YAP1是偏头痛易感基因之一。miR-375被认为是偏头痛儿童和青少年偏头痛的诊断生物标志物。然而，与HCs相比，miR-375在偏头痛患者中的表达水平与本研究相反。

这是第一项探索MWoA和HCs患者之间差异表达的血清衍生外泌体miRNA的研究。由于这些miRNA的高精度，我们的研究表明这些外泌体miRNA可用于诊断偏头痛，尽管需要进一步的大规模研究来确认。

我们还筛选了另外两种可作为MWoA患者TA治疗预后生物标志物的miRNA，即has-miR-378c和has-miR-1292-5p。在之前的一项研究中，miR-378c直接靶向神经纤毛蛋白1（NRP1），NRP1也是一种偏头痛易感基因。然而，少数研究探索了has-miR-1292-5p的功能，并表明它可用于预测胃癌的预后。先前的研究结果强调了药物治疗和miRNA之间的功能串扰，因为药物管理可能间接影响miRNA表达谱。相反，一些特定的miRNA可能与药物反应指标相关。一项研究表明，has-miR-34a-5p和has-miR-375可能是MWoA患者疾病和药物疗效的有用生物标志物。尽管相关研究的数量非常有限，但我们知道特异性miRNA既可以作为药物的新分子靶标，也可以作为检测药物反应和疗效的生物标志物。在我们的研究中确定了五个预后标志物。这五种外泌体miRNA可能是缓解偏头痛的新分子靶点，可用于检测针刺反应和预测针刺疗效。

结论  

此研究确定了三种miRNAs，它们可以作为诊断生物标志物来预测TA的治疗效果。本研究为从外泌体miRNA的角度进一步探索偏头痛的诊断和预后生物标志物提供了依据。此外，研究推断TA治疗的潜在机制可能是直接靶向偏头痛相关基因的外泌体miRNA的调节。

中西合璧论述：    

本研究对偏头痛患者针刺治疗前后的血清外泌体miRNA谱进行了研究。研究结果提高了我们对MWoA中miRNA分子功能的理解。从外泌体miRNA的角度进一步探索偏头痛的诊断和预后生物标志物提供了依据。

研究中检测了4周治疗前后HC、trAMWoA和shAMWoA组的外泌体miRNA。HC与MWoA患者之间的DEmiRs，发现主要富集在PI3K-Akt、Hippo、FoxO和p53信号通路。此外，TA可能通过调节PI3K-Akt、Hippo和FoxO信号通路在MWoA患者中发挥治疗作用。另外，此研究还筛选了另外两个可以作为MWoA患者TA治疗的预后生物标志物的miRNAs，即hsa-miR-378c和hsa-mir-1292-5p。本研究的主要局限性是样本量，这限制了性别差异对偏头痛患者外泌体miRNA表达影响的分析。其次，需要动物研究来确定针刺的作用机制是否由外泌体miRNAs介导。此外，这三种miRNAs(hsa-miR-369-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-5,010-3p)的功能和靶点还需要进一步的体外或体内研究。目前对于外泌体参与针刺调节的机制仍有待探索，但本文为其提供了新的方向，也对针刺在治疗偏头痛方向提供了有力证据。

翻译：徐煜婕

评述：许华 

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