Nature | 细菌世界的黑科技——BAM介导的外膜桶蛋白的神秘组装方式

外膜结构普遍存在于革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体中，其中，β-桶状蛋白 (Outer membrane proteins, OMPs) 是细菌外膜的主要蛋白成分，是物质交换的重要入口，在代谢物运输、信号传递和膜生物发生中起重要作用1。所有已知的OMP都具有反平行的β-链拓扑结构，这意味着它们具有共同的进化起源和保守的折叠机制。细菌中的OMP功能障碍将导致死亡或抗生素耐药性，人类线粒体中的OMP功能障碍将导致严重疾病。

细菌BAM存在于所有革兰氏阴性菌中，是一种潜在的新型抗生素靶点2。细菌在细胞质中新合成的OMP首先通过SecYEG 易位子在内膜上易位3，然后由质周伴侣蛋白护送到细胞外膜 (Outer membrane, OM)，在那里由BAM组装成OMP桶。BAM由一种OMP85蛋白BamA和四种辅助脂蛋白BamB-BamE组成。BamA含有一个C端嵌入膜中的16股β桶和五个N端的多肽运输相关结构域 (POTRA1-5)，它们与BamBCDE相互作用形成一个周质环。有人提出，BAM采用“旋转和插入”机制，其中周质间成分旋转以侧向打开BamA桶，促进OMPs逐步插入膜中而不使用外源能量（图1）。然而，BAM完成OMP组装的机制尚不清楚。

图 1 OMP通过BAM从细胞质转运和组装到外膜

2023年4月26日，四川大学华西医院董浩浩、唐晓迪实验室与浙江大学医学院张兴实验室、浙江大学生命科学院周如鸿实验室合作，在Nature期刊上发表了题为Structural basis of BAM-mediated outer membrane β-barrel protein assembly 的论文。研究者报道了BAM与OMP底物 (EspP) 结合的高分辨率冷冻电镜结构，在OMP组装后期显示出不同的构象。结合体内功能实验、体外底物折叠实验和分子动力学模拟，揭示了BAM介导的OMP组装机制。

体内的OMP组装通常太快而无法捕获它们的折叠中间体。研究者采用了先前报道的方法，使用OMP底物EspP，N端与MBP标签融合，以阻止BAM对OMP的组装。研究者将BAM复合物与MBP - EspP融合蛋白共表达，为了稳定该复合物，研究者还在预测的BamA和EspP桶之间的混合界面上设计了二硫键的蛋白质，在不同位置引入四对半胱氨酸突变，pair1，pair1+4，pair2 和pair3，旨在捕获具有不同构象的组装中间体。在脂质纳米盘中纯化BAM-EspP复合物，并基于冷冻电镜进行结构解析。

纳米盘中BAM-pair1-EspP、BAM-pair1+4-EspP、BAM-pair2-EspP和BAM-pair3-EspP的低温电镜结构分别为3.3、3.4、3.4和3.1 Å的全局分辨率。这些结构的总体构象是一致的，包含BAM的五个组分 (BamA-E) 和一个未完成的EspP β-桶，其N端螺旋穿过桶腔。这些结构代表BAM-EspP复合物在桶状结构的折叠、闭合和释放过程中的状态。

图 2 BAM与底物EspP中间组装复合物的冷冻电镜结构

在结构中捕获的BamA-EspP复合物的独特构象特征揭示了BAM介导的OMP组装的分子机制。在BAM-pair1-EspP和BAM-pair1+4-EspP结构中，BamA桶呈横向开放构象，通过BamA β1与EspP β12的β-信号链相互作用，BamA的N端与EspP的C端完全杂交成平面界面，剩余的11条EspP β-链从杂化界面连续地向其N端折叠成β-片。EspP的N端β-链不与BamA的C端β-链相遇，而是通过与细胞外的β12相互作用，向内盘绕，短暂地闭合成一个桶状（图3a-d）。BamA的C端链和EspP的N端链的桶状表面残基暴露出疏水侧链，桶之间的疏水性可能参与诱导新折叠的OMP β-片闭合到桶内。

尽管BAM-pair1-EspP和BAM-pair1+4-EspP结构都表现出开放的桶杂化状态，但它们之间存在显著的构象差异。BAM-pair1+4-EspP结构在BamA β1和EspP β12之间显示出倾斜的杂化界面，与BamA的开放晶体结构类似。相比之下，BAM-pair1-EspP结构显示出相对直的杂化界面，类似于半封闭的BAM-pair2-EspP结构和封闭的晶体结构，显示了BamA桶的“准备关闭”状态。杂化界面从周质边缘向外偏转，为EspP的C端链向桶腔倾斜提供了杠杆效应，这可能激发EspP β-片的滚动，使桶从细胞外边缘闭合（图3e-h）。根据BamA和EspP在这两种结构中的构象，BAM-pair1+4-EspP复合物可能表现出BamA介导的OMP组装的初始桶杂化状态，而BAM-pair1-EspP则表现出组装的后构象过渡状态，比BAM-pair1+4-EspP晚。

图 3 BAM-pair1 - EspP与BAM-pair1+4 - EspP开放态结构比较

为了研究β-链的正确几何形状在桶状结构组装中的重要性，研究者删除了EspP的细胞外环 (extracellular loop, ECL)，以增加相邻链之间的刚度，从而使某些链不会在筒体空间内折叠（图4a）。结果显示，分别删除连接β1和β2或连接β12和β11的编码ECL1或ECL6的基因，可以减少体外EspP的组装，而删除其他ECL (∆ECL2-5) 则没有影响（图4a-b）。用等长丙氨酸修复∆ECL1，在体外和体内均恢复了EspP组装，表明ECL1在结构上对桶闭合很重要。同时，丙氨酸修复后，∆ECL6恢复了EspP的膜插入，但没有恢复EspP的成熟，这表明ECL6在EspP组装中具有特定作用。与ECL相比，删除外周质环 (∆Ts) 均影响体外EspP组装。丙氨酸修复完全恢复了EspP (∆T1) 和EspP (∆T4) 的组装（图4b），这表明剩余的环（T2, T3和T5）对EspP的组装特别重要。

研究者随后通过双脯氨酸替换β-链残基来破坏EspP和BamA的N-末端和C-末端β-链的次级结构，以研究其在组装中的重要性（图4c-h）。结果表明，包括BamA在内的OMP的C端β信号链对于膜插入和桶状结构的形成至关重要，而N端β-链对于桶形结构的闭合非常重要。

图 4 体外EspP组装和细胞活力测定

BAM-pair2-EspP和BAM-pair3-EspP显示了底物桶闭合和释放的组装复合物的晚期状态。在BAM-pair2-EspP结构中，N端链从杂合桶界面的胞外端剥离。BamA和EspP桶通过二硫键和两个氢键在BamA β1和EspP β12的胞外端保持相互作用（图5c）。连接BAM-pair2-EspP中BamA N端β-链的ECL1、ECL2和ECL3向BamA桶的腔内弯曲（图5e）。BAM-pair3-EspP结构揭示了BAM介导的组装的最终状态，其中BamA和EspP桶几乎关闭，仅通过二硫键在胞外边缘连接（图5c-d）。与BAM-pair2-EspP中弯曲的BamA N端链相比，BAM-pair3-EspP中的BamA β1被拉直并与β16相互作用以关闭桶（图5f-g），这是一种向内闭合的构象（图5h）。这些结果表明，底物桶的闭合是由BAM的主动作用促进的，它释放并改变β信号链的构象，以允许底物桶的闭合。

图 5 BAM-pair2-EspP和BAM-pair3-EspP结构比较

总的来说，研究者通过捕获BAM与EspP在四种不同状态下的复合物，展示了完全打开、准备关闭、半闭合和完全闭合的BAM-EspP中间复合物结构。首先，OMP底物的折叠是通过将其β信号链与来自胞外的BamA β1相互作用来启动的，底物β信号链与BamA β1相互作用的方向是特定的，遵循从BamA β1作为模板的反平行片模式。BamA桶的内向闭合构象已确保β缝合只在β1的胞外端与β16结合，留下未配对的胞外端来纳入即将到来的底物（图6）。此项工作揭示了BAM介导的桶闭合和释放的结构细节，提供了对OMP完整组装机制的深入理解，可能为开发有效的抗菌剂提供新的功能抑制靶标。

图 6 BAM装配机制图

参考文献

[1] Lundquist, K., Billings, E., Bi, M., Wellnitz, J. & Noinaj, N. The assembly of β‐barrel membrane proteins by BAM and SAM. Mol. Microbiol. 115, 425–435 (2021).

[2] Imai, Y. et al. A new antibiotic selectively kills Gram-negative pathogens. Nature 576, 459–464 (2019).

[3] Mori, H. & Ito, K. The Sec protein-translocation pathway. Trends Microbiol. 9, 494–500 (2001).

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

排版 | 可洲